猪圆环病毒2型的分离鉴定及增殖特性的研究

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）自1974年被发现以来,在1997年被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病原,也是引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated diseases,PCVAD）的主要原因。圆环病毒还经常与其他病原并发感染,引起免疫抑制而加重患病猪的病情,近年来被广泛关注。目前从各地分离得到的猪圆环病毒在基因型方面存在一定的变异情况,各地的流行情况也不尽相同。对猪圆环病毒进行分离鉴定并进行基因进化分析以及毒力测定,可为了解该病毒的流行及变异情况提供基础资料。目前普遍采用的是用PK-15细胞来进行猪圆环病毒的增殖,但存在病毒滴度不高的问题。对病毒增殖的宿主细胞和培养条件进行研究,可为猪圆环病毒致病机理的研究及研制针对性更强的疫苗提供更多的病毒材料。本研究获得了以下结果:（1）从猪圆环病毒2型的阳性病料中分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察确定其为猪圆环病毒2型（PCV-2）毒株。（2）用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）,测定分离毒株的病毒滴度（TCID50）,并对其全基因组序列进行测定和分析,得出分离株在PK-15细胞上的TCID50效价为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株（DQ200735）同源性最高（99.4%）。（3）用分离到的PCV-2分别感染PK-15细胞、猪血管内皮细胞（SUVEC）和猪气管上皮细胞（STEC）,通过PCR、real-time PCR和免疫荧光检测等方法对病毒的增殖滴度进行检测。表明病毒增殖的最佳条件是用100g/L DMEM在PK-15细胞中于37℃、5%CO2条件下培养培养72～96h。最后再用体外滚环方法检测出了3种细胞中病毒的复制中间体,证明PCV-2可以感染猪血管内皮细胞和猪气管上皮细胞。（4）将PCV-2接种PK-15细胞,并用IFN-γ和NH4Cl作用病毒和细胞,发现用75 mmol/L NH4Cl和500 U/mL IFN-γ作用72h,可使病毒滴度大大提高,并且不论IFN-γ在病毒接种前添加还是在病毒接种后添加,其作用效果相当。综上所述,本研究成功分离得到一株猪圆环病毒2型毒株,分离株在PK-15细胞上的TCID50效价为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株（DQ200735）同源性最高（99.4%）。通过病毒在3个不同猪源细胞系上的增殖,表明PCV-2可以感染SUVEC和STEC,但是PK-15细胞仍然是病毒的最适增殖细胞;另外,用75 mmol/L NH4Cl和500 U/mL IFN-γ作用72h,可使病毒滴度大大提高,为进一步研究PCV-2致病机理奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪圆环病毒研究进展
• 1.1 猪圆环病毒的发现、命名及分类
• 1.2 猪圆环病毒的病原学特征
• 1.2.1 PCV 的生物学特性
• 1.2.2 PCV-2 毒力的变化
• 1.2.3 PCV 细胞培养特性
• 1.3 猪圆环病毒的基因组结构
• 1.4 猪圆环病毒的复制与转录
• 1.5 猪圆环病毒的致病机理
• 1.6 流行病学研究
• 1.6.1 传播途径
• 1.6.2 导致PMWS 发展蔓延的因素
• 1.7 预防和控制
• 1.7.1 加强管理
• 1.7.2 血清疗法和动物免疫
• 1.8 猪圆环病毒相关疾病
• 1.8.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
• 1.8.2 先天性震颤
• 1.8.3 呼吸系统疾病
• 1.8.4 皮炎与肾病综合征
• 1.9 PCVD 的诊断
• 1.9.1 聚合酶链式反应（PCR）
• 1.9.2 间接免疫荧光试验（IFA）
• 1.9.3 免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）
• 1.9.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.9.5 原位杂交（ISH）
• 试验研究
• 第二章 猪圆环病毒2 型的分离鉴定及序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品来源和处理
• 2.1.2 细胞和菌株
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器及设备
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 病料中PCV-2 的检测
• 2.2.2 病毒的分离培养与纯化
• 2.2.3 PCV-2 分离病毒的鉴定
• 2.2.4 PCV-2 分离株病毒全序列扩增及比较分析
• 2.2.5 分离病毒毒价的测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 病料中PCV-2 的检测
• 2.3.2 PCR-RELP 结果
• 2.3.3 分离病毒的鉴定
• 2.3.4 分离病毒全基因组的序列测定及分析
• 2.3.5 分离毒株病毒滴度的测定结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 PCV-2 在3 种猪源细胞上的增殖
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞和毒株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 3 种细胞上接种PCV-2
• 3.2.2 PCV-2 的鉴定
• 3.2.3 实时定量方法的建立与病毒的检测
• 3.2.4 体外滚环复制方法（RCA）对复制中间体的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 特异性PCR 扩增结果
• 3.3.2 间接免疫荧光结果
• 3.3.3 透射电镜
• 3.3.4 实时定量PCR 检测
• 3.3.5 RCA 方法对复制中间体的检测
• 3.3.6 三种细胞接毒前后照片
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 IFN-γ对PCV-2 增殖效果的影响
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 仪器及设备
• 4.2 方法与步骤
• 4.2.1 重组IFN-γ对分离病毒的培养
• 50)'>4.2.2 免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）对病毒毒价的测定(TCID₅₀)
• 4.2.3 IFN-γ作用后细胞周期的测定
• 4.3 结果
• 50'>4.3.1 IFN-γ培养病毒后的TCID₅₀
• 4.3.2 细胞周期的测定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介