论文摘要
目的:观察糖尿病血清（Diabetic serum,DS）对银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract, GBE）、银杏内酯（Ginkgolides B, GB）和阿托伐他汀（Atovastatin,AT）预处理的血管内皮细胞的损伤作用和β-淀粉样肽（Amyloid-β,Aβ）的变化,探讨DS引起内皮细胞损伤的机制及GBE和GB的保护作用,为内皮保护策略防治糖尿病血管并发症提供实验依据。方法:DS对不同药物预处理的ECV-304细胞的损伤效应及评定。用GBE、GB和AT预处理ECV-304细胞24h,然后加入10%的DS,分别称为GBE组、GB组和AT组,同时设糖尿病血清组（DS）。30min、3h以及72h倒置显微镜观察形态学变化;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测3d时细胞增殖情况;各时间点上清液中检测乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）评定细胞膜损伤程度、检测丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）评定脂质过氧化情况以及检测一氧化氮（Nitric oxide,NO）了解内皮功能。采用ELISA方法检测上述各时间点细胞培养上清液中的Aβ40和Aβ42,探讨DS诱导内皮损伤机制及GBE和GB的保护机制。结果:1.糖尿病血清对不同药物预处理的ECV-304细胞的损伤效应及评定。细胞形态:30min及3h各组无明显变化,3d DS组可见细胞变圆、皱缩和胞体碎裂,排列紊乱,数量减少;AT组无明显变化;GB和GBE组呈现明显的保护作用,可见内皮细胞为多角形,形态结构清晰,大小均匀,呈单层鹅卵石状紧密排列。细胞生存率（%）,30min和3h各组无显著性差异;3d GBE（119.5±1.6,P< 0.001）、GB（108.8±1.9,P<0.01）和AT（120.4±3.7,P<0.01）与DS组（96.7±2.1）比较均明显增高,以GBE和AT为著（P<0.001）。LDH水平（U/L）,30min各组无显著性差异（P>0.05）;3h和3d,GBE（770.6±40.5,P< 0.01;912.2±34.2,P< 0.05）、GB（861.1±36.5,P<0.05;955±29.8,P<0.05）与DS组（1054±38.9,1211±54.32）比较均显著降低,AT（896.1±43.6,1060.9±38.3）与DS组比较无明显降低（P>0.05）。MDA含量（μM）,30min各组无显著性差异（P>0.05）;3h和3d,GBE（7.76±0.42,P< 0.05;6.47±0.45,P< 0.01）、GB（8.90±0.17,P<0.05;8.24±0.37,P<0.01）、AT（7.95±0.37,P< 0.05;7.95±0.42,P< 0.01）与DS（9.52±0.13,12.43±0.62）组比较均显著降低,以GBE为著。NO水平（μM）,30min各组无显著性差异（P>0.05）;3h:GBE（93.8±11,P< 0.01）、GB（144.2±19,P<0.01）、AT（147.2±21,P<0.01）与DS（50.2±1.9）组比较NO浓度升高;72h:GBE（65.9±0.7,P< 0.05）、AT（71.3±2.8,P<0.05）与DS（41.25±6.4）组比较NO浓度升高,GB（38.8±11,P>0.05）与DS组比较NO无统计学差异。2.糖尿病血清对不同药物预处理的ECV-304细胞培养上清中Aβ40和Aβ42浓度的影响。DS组Aβ42浓度（pM）（7.43±0.25,P< 0.001;7.51±0.20,P< 0.001;11.64±0.19,P< 0.001）较糖尿病血清（0.52±0.05）明显增多。Aβ40浓度（pM）（9.66±0.21,P< 0.001;11.19±0.53,P< 0.001;55.24±0.27,P< 0.001）较糖尿病血清（0.74±0.05）也是明显增多。Aβ42浓度（pM）,GBE（2.37±0.17,P< 0.001;2.34±0.11,P< 0.001;2.7±0.10,P< 0.001）、GB（2.37±0.15,P< 0.001;4.1±0.17,P< 0.001;5.7±0.19,P< 0.001）及AT组（5.29±0.23,P<0.001;5.2±0.09,P<0.001;4.9±0.17,P<0.001）较DS组（7.41±0.25,7.51±0.11,11.6±0.11）明显降低。GBE和GB较AT组明显降低,以GBE更著。Aβ40浓度（pM）,GBE（0.27±0.06,P< 0.001;3.68±0.22,P< 0.001;36.4±0.22,P< 0.001）、GB（0.18±0.14,P< 0.001;4.94±0.20,P< 0.001;43.1±0.22,P< 0.001）及AT组（2.81±0.12,P<0.001;9.63±0.21,P<0.001;38.9±0.14,P<0.001）较DS组（9.74±0.43,9.58±0.16,55.2±0.16）明显降低,以GBE更著。结论:1.DS通过氧化应激反应损伤内皮,并且Aβ40和Aβ42参与了这一损伤过程,Aβ42在这一损伤中起主要作用。2.GBE和GB抑制DS诱导的内皮氧化应激损伤可能是通过抑制Aβ的生成实现的。3.GBE、GB和AT对内皮细胞的保护作用不同,GBE的保护效应更为显著。