白菜雄性不育相关新基因BcMF1的克隆和功能验证

论文摘要

芸薹属是十字花科植物的重要类群，也是我国栽培面积最大的蔬菜作物。白菜（Brassica campestrisL．ssp．chinensis Makino）是芸薹属芸薹种的一个亚种，是典型的异花授粉作物，具有显著的杂种优势，F1代杂种的推广应用可以提高白菜的生产水平。雄性不育材料在白菜F1代种子的生产中具有重要地位，其选育和利用日益受到人们的重视。以白菜雄性不育材料为基础，分析雄性不育相关基因的表达特征，分离雄性不育相关基因并验证基因的功能，不仅可以促进白菜雄性不育材料的选育，而且对于揭示植物雄性不育的分子机制也具有重要的理论意义。本文以‘矮脚黄’白菜隐性核雄性不育两用系为研究对象，在前人获得雄性不育相关新基因Brassica campestris Male Fertility 1（BcMF1）的cDNA拼接序列的基础上，通过PCR进一步克隆BcMF1的DNA全长和cDNA全长；通过TAIL PCR技术克隆该基因的启动子序列；对BcMF1及其启动子的序列特征以及编码蛋白的功能进行分析和预测；并在几种芸薹属植物中进行BcMF1同源基因的克隆和进化分析。为验证BcMF1的功能，构建了RNA干涉（RNAi）和反义RNA植物表达载体，在分析菜心BcMF1同源基因表达特征的基础上，通过农杆菌介导法转化菜心植株，获取BcMF1表达沉默的卡那霉素抗性植株，对转基因植株的花粉发育状态进行观察，深入分析BcMF1在白菜花粉发育中的生物学功能。本研究获得的主要结果如下：（1）根据表达差异片段BcMF-A15T17及其RACE扩增序列设计引物，PCR扩增得到BcMF1准确的cDNA全长和DNA全长序列，cDNA全长为1 684 bp，基因全长为1 985 bp，含有两个内含子和3个外显子，最大开放阅读框为1 416 bp，预测该基因可编码一个含有471个氨基酸的蛋白质。不计算70 bp的3’末端A／T丰富序列和poly T尾部结构，前人所得到的cDNA拼接序列为1613 bp，最大开放阅读框为1344 bp，预期可编码一个含有447个氨基酸的蛋白质。本文的结果校正了前人cDNA拼接序列及其预测的氨基酸序列的误差。在GeneBank中没有发现与BcMF1同源性较高的功能已知基因，BcMF1仅与拟南芥未知功能蛋白家族DUF1216的相似性较高，是第一个被报导的DUF1216表达基因，蛋白质特征分析显示BcMF1基因编码蛋白很可能是一个定位在细胞外的分泌蛋白。（2）以两用系的可育株群和不育株群为研究对象，使用Northern杂交的方法较全面地分析了BcMF1的转录表达特征，结果显示BcMF1仅在可育株系的中花蕾、大花蕾、花以及雄蕊中特异表达，在不育株系中不表达。因此，BcMF1是一个与白菜育性相关的新基因。（3）通过PCR在不育株中扩增了BcMF1序列，通过TAIL PCR在两用系可育株和不育株中同时扩增了该基因的启动子序列，从DNA水平上探讨该基因表达差异形成的分子机理。序列比对发现BcMF1及其启动子序列在可育株和不育株中没有出现变异，表明该基因的这种表达差异不是因为基因或启动子序列突变所引起的，推测BcMF1的表达受其他基因的调控。在BcMF1启动子序列中，发现了一些与光诱导响应、激素响应和胁迫响应有关的顺式作用元件，推测BcMF1的表达可能受到光条件、内外源激素以及逆境胁迫的影响（4）根据BcMF1的全长序列设计引物，在7种芸薹属蔬菜作物中克隆到BcMF1的同源序列，BcMF1同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平相似性分别为97．8％～99．6％和95．3％～98．9％。以同源基因的多序列比对为基础，对7种芸薹属蔬菜作物的BcMF1同源基因进行系统分析，揭示了BcMF1同源基因在这些蔬菜作物中的进化关系。（5）克隆了菜心BcMF1同源基因并分析其表达特征，证明了菜心适用于白菜BcMF1的功能分析。构建了RNA干涉表达载体pBcMF1-RNAi和反义RNA表达载体pBcMF1-AS，农杆菌介导法转化菜心，获得了Kan抗性菜心植株。分子检测表明已得到了BcMF1-AS转基因植株和BcMF1-RNAi转基因植株，Northern杂交显示BcMF1的表达在转基因植株中受到抑制。对转基因植株的生长状况、花器官发育、花粉形态、花粉离体萌发率以及花粉发育过程进行观察，发现抑制BcMF1的表达可以影响菜心植株的花粉发育，因此推论BcMF1是一个与白菜花粉发育相关的新基因。（6）根据pBI121质粒多克隆位点两侧的DNA序列设计一对通用引物，以几种pBI121表达载体及其转基因植株为模板进行PCR扩增，并使用限制性内切酶BamHⅠ酶切分析来验证扩增条带的真实性，检测结果与常规鉴定方法完全一致，为各种pBI121表达载体及其转基因植株的鉴定提供了一种快速、有效的方法。

论文目录

• 致谢
• 缩写词
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 ‘BAJH97-01A/B’矮脚黄白菜核雄性不育两用系的研究进展
• 1.1.1 来源与特点
• 1.1.2 植物学性状观察
• 1.1.3 细胞学研究
• 1.1.4 生理生化指标比较
• 1.1.5 基因的表达差异分析
• 1.1.6 雄性不育相关基因的克隆和功能验证
• 1.2 植物表达载体系统的研究进展
• 1.2.1 早期的植物表达载体系统
• 1.2.1.1 两个典型的早期植物表达载体
• 1.2.1.2 早期植物表达载体的改良
• 1.2.2 植物表达载体系统的研究现状
• 1.2.2.1 植物RNA干涉技术中的表达载体
• 1.2.2.2 植物病毒表达载体
• 1.2.2.3 Gateway技术和表达载体的模块化构建
• 1.2.2.4 自体荧光蛋白标签中的表达载体
• 1.2.2.5 双分子荧光互补技术中的表达载体
• 1.2.2.6 CRE/loxP重组介导系统中的表达载体
• 1.2.2.7 应用在特殊研究领域中的双元载体
• 1.2.2.8 面向新的遗传转化对象的双元载体
• 1.2.2.9 其他类型的植物表达载体
• 1.3 植物选择标记基因及其去除方法
• 1.3.1 植物选择标记基因
• 1.3.1.1 负向选择标记基因
• 1.3.1.2 正向选择标记基因
• 1.3.1.3 两类选择标记基因的比较
• 1.3.2 植物选择标记基因的去除方法
• 1.3.2.1 依赖于有性杂交的方法
• 1.3.2.2 不依赖于有性杂交的方法
• 1.3.2.3 利用叶绿体遗传工程产生无抗生素标记转基因植物
• 2 白菜雄性不育相关基因BCMF1的克隆验证与特征分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 基因组DNA提取
• 2.1.3 总RNA提取
• 2.1.4 cDNA的合成
• 2.1.5 cDNA和DNA全长序列的扩增
• 2.1.6 基因的序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 BcMF1的cDNA和DNA全长序列的验证
• 2.2.2 BcMF1核苷酸序列分析
• 2.2.3 BcMF1编码蛋白的特征分析
• 2.3.4 BcMF1氨基酸同源序列分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 BcMF1的cDNA全长的差异比较
• 2.3.2 BcMF1编码蛋白的功能预测
• 2.3.3 BcMF1功能研究有助于了解DUF1216蛋白家族成员的功能
• 3 白菜雄性不育两用系的BCMF1表达差异分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 表达特征分析
• 3.1.2.1 总RNA提取和电泳
• 3.1.2.2 转膜
• 3.1.2.3 探针的标记
• 3.1.2.4 杂交
• 3.1.3 基因全长序列扩增
• 3.1.4 启动子序列扩增
• 3.1.4.1 TAIL PCR的引物设计
• 3.1.4.2 TAIL PCR扩增
• 3.1.4.3 可育株启动子序列的克隆和测序
• 3.1.4.4 PCR扩增不育株的启动子序列
• 3.1.5 序列比对和特征分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 BcMF1的表达差异比较
• 3.2.2 不育株群BcMF1全长序列获得和比对
• 3.2.3 BcMF1启动子序列获得和序列比对
• 3.2.3.1 可育株群BcMF1启动子序列的TAIL PCR扩增
• 3.2.3.2 不育株群BcMF1启动子序列的PCR扩增和比对
• 3.2.4 BcMF1启动子序列的特征分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 BcMF1的表达特征
• 3.3.2 BcMF1的表达可能受到上游基因的调控
• 3.3.3 影响BcMF1表达的可能因素
• 4 BCMF1基因的功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 菜心同源基因的克隆与表达特征分析
• 4.1.2.1 同源基因的克隆
• 4.1.2.2 同源基因的表达特征分析
• 4.1.3 表达载体构建及农杆菌转化
• 4.1.3.1 反义表达载体的构建
• 4.1.3.2 RNAi表达载体的构建
• 4.1.3.3 植物表达载体转化农杆菌
• 4.1.4 植物表达载体的遗传转化
• 4.1.4.1 培养基配方
• 4.1.4.2 播种
• 4.1.4.3 预培养
• 4.1.4.4 共培养
• 4.1.4.5 分化培养
• 4.1.4.6 生根培养
• 4.1.4.7 移栽
• 4.1.5 转基因植株的分子检测
• 4.1.5.1 转基因植株DNA和总RNA提取
• 4.1.5.2 转基因植株的PCR检测
• 4.1.5.3 转基因植株的Southern印迹杂交检测
• 4.1.5.4 转基因植株的GUS组织化学染色
• 4.1.5.5 转基因植株的Northern印迹杂交检测
• 4.1.6 转基因植株的形态学和细胞学观察
• 4.1.6.1 转基因植株的形态学观察和育性调查
• 4.1.6.2 转基因植株花粉生活力观察
• 4.1.6.3 转基因植株花粉的扫描电镜观察
• 4.1.6.4 转基因植株花粉离体萌发实验
• 4.1.6.5 转基因植株小孢子发育的细胞学观察
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菜心BcMF1同源基因的克隆与表达特征分析
• 4.2.2 pBcMF1-AS和pBcMF1-RNAi表达载体的获得
• 4.2.3 pBcMF1-AS和pBcMF1-RNAi表达载体转化菜心植株
• 4.2.4 pBcMF1-AS和pBcMF1-RNAi转化植株的分子检测
• 4.2.4.1 菜心转化植株的PCR检测
• 4.2.4.2 菜心转化植株的Southern印迹杂交检测
• 4.2.4.3 菜心转化植株的GUS组织化学染色
• 4.2.4.5 菜心转基因植株的Northern印迹杂交检测
• 4.2.5 pBcMF1-AS和pBcMF1-RNAi转化植株的形态与细胞学观察
• 4.2.5.1 转化植株的形态学观察和育性调查
• 4.2.5.2 转化植株花粉生活力观察
• 4.2.5.3 转化植株花粉形态的扫描电镜观察
• 4.2.5.4 转化植株花粉离体萌发调查
• 4.2.5.5 菜心转化植株花粉发育的细胞学观察
• 4.3 讨论
• 4.3.1 BcMF1是一个与白菜花粉发育相关的新基因
• 4.3.2 BcMF1在菜心植株中的遗传转化
• 5 芸薹属植物BCMF1同源序列的克隆与进化分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 同源基因的克隆和测序
• 5.1.3 同源基因的序列差异分析
• 5.1.4 同源基因的系统进化分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 BcMF1同源序列的扩增和克隆
• 5.2.2 BcMF1同源序列特征分析
• 5.2.3 BcMF1同源基因的序列比对
• 5.2.4 芸薹属植物BcMF1同源基因序列的遗传距离分析
• 5.2.5 芸薹属BcMF1同源基因的系统分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 芸薹属植物BcMF1同源基因的分子克隆
• 5.3.2 芸薹属植物BcMF1同源基因的分子进化
• 6 PBI121表达载体及其转化植株快速鉴定方法研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料与试剂
• 6.1.2 pBI121表达载体和转化植株的获得
• 6.1.3 通用引物设计、PCR扩增和测序
• 6.1.4 PCR扩增产物的酶切分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 表达载体鉴定通用引物的PCR扩增
• 6.2.2 表达载体PCR产物的酶切分析
• 6.2.3 RNAi表达载体PCR产物的测序验证
• 6.2.4 RNAi表达载体转化植株的快速鉴定
• 6.3 讨论
• 6.3.1 快速鉴定的方法也是简单、高效的鉴定方法
• 6.3.2 在pBI121重组质粒插入小片段的鉴定中,PCR的产物酶切鉴定具有显著优势
• 结论
• 参考文献
• 博士学位攻读期间发表的论文