水稻基因打靶与悬浮细胞团转基因体系研究

论文摘要

水稻Bel基因编码的细胞色素P450单加氧酶CYP81A6使水稻产生对除草剂苯达松的抗性,采用基因打靶技术对水稻Bel基因进行定点敲除,能有效地获得苯达松敏感致死株。不同臂长的打靶载体的打靶效率不同。本研究构建了左右臂长约2kb的打靶载体pRB2和包含了长约4kb左右臂的中间载体pJL9,并利用pRB2载体对世锦B的Bel基因进行打靶。本研究还初步建立了农杆菌介导的世锦B悬浮细胞团转基因体系。主要结果如下:1.构建了Bel基因打靶载体pRB2,与Bel基因区域同源的左右臂长度分别为2224bp和2394bp,并含有潮霉素正向选择标记和白喉毒素负向选择标记。正在构建左右臂长度分别约为4kb的打靶载体,目前已构建出含4373bp左臂、3936 bp右臂和正选择标记的中间载体pJL9。2.用Bel基因打靶载体pRB2对15.425g水稻愈伤组织进行转化,对3颗抗性愈伤组织分化出的28株水稻进行PCR检测,获得了27株转基因水稻,但都为随机插入,没有中靶植株。3.本实验初步建立了农杆菌介导的世锦B悬浮细胞团转基因体系:利用世锦B成熟种子诱导愈伤组织并悬浮培养,得到生长旺盛的细胞团。将细胞团先在N6Ⅱ培养基上预培养1周,再用农杆菌侵染并在N6Ⅱ培养基上共培养,在含头孢霉素250mg/L、羧苄青霉素250mg/L、潮霉素50mg/L的N6Ⅰ培养基上筛选,抗性愈伤接入MSⅠC分化培养基中,成苗后接入MSⅡ培养基中长成植株。抗性植株经PCR鉴定表明,外源基因已成功整合到世锦B的基因组中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 水稻Bel基因打靶载体的构建及转化
• 1.1 引言
• 1.1.1 植物基因工程
• 1.1.1.1 抗除草剂植物基因工程
• 1.1.1.2 抗虫植物基因工程
• 1.1.1.3 抗病植物基因工程
• 1.1.1.4 抗逆境转基因工程
• 1.1.1.5 植物基因工程中存在的问题及展望
• 1.1.2 基因打靶技术
• 1.1.2.1 基因打靶机制
• 1.1.2.2 基因打靶策略
• 1.1.2.3 基因打靶过程
• 1.1.2.4 影响打靶效率的因素
• 1.1.2.5 植物基因打靶技术的发展
• 1.1.2.6 植物基因打靶的应用
• 1.1.3 水稻苯达松敏感致死突变基因的研究
• 1.1.3.1 水稻苯达松敏感致死性突变材料
• 1.1.3.2 水稻苯达松敏感致死突变基因的遗传学研究
• 1.1.3.3 水稻苯达松敏感致死突变基因的定位及相关研究
• 1.1.3.4 苯达松敏感致死基因在水稻杂交制种中的应用
• 1.1.4 本实验的目的和意义
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 载体与菌株
• 1.2.2 主要酶或试剂
• 1.2.3 细菌培养基
• 1.2.4 植物材料
• 1.2.5 水稻培养基和营养液
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 水稻叶片基因组DNA提取
• 1.3.2 水稻Bel基因区域PCR扩增
• 1.3.3 连接反应
• 1.3.4 大肠杆菌感受态的制备
• 1.3.5 质粒的转化
• 1.3.6 菌体PCR
• 1.3.7 提取质粒
• 1.3.8 限制性内切酶酶切
• 1.3.9 左右同源臂分别为2 kb打靶载体的构建
• 1.3.10 载体pJL9的构建
• 1.3.11 农杆菌EHA105的电激转化
• 1.3.12 农杆菌介导水稻Bel基因pRB2打靶载体的转化
• 1.3.13 无菌苗移栽
• 1.3.14 抗性水稻PCR检测
• 1.4 结果与分析
• 1.4.1 pRB2打靶载体构建
• 1.4.1.1 同源臂PCR扩增与克隆载体构建
• 1.4.1.2 中间载体构建
• 1.4.1.3 打靶载体构建
• 1.4.2 中间载体pJL9构建
• 1.4.2.1 PCR扩增与同源臂克隆载体构建
• 1.4.2.2 中间载体pJL7、pJL8和pJL9构建
• 1.4.3 农杆菌介导pRB2打靶
• 1.4.4 抗性植株PCR鉴定
• 1.4.4.1 转化体鉴定
• 1.4.4.2 中靶植株鉴定
• 1.5 讨论
• 1.5.1 载体构建
• 1.5.2 打靶材料的选择
• 1.5.3 打靶外植体分化
• 1.5.4 展望
• 第2章 农杆菌介导的世锦B悬浮细胞团转基因体系的初步建立
• 2.1 引言
• 2.1.1 植物转基因技术
• 2.1.1.1 PEG（聚乙二醇）介导法
• 2.1.1.2 电激法
• 2.1.1.3 花粉管通道法
• 2.1.1.4 基因枪法
• 2.1.1.5 农杆菌介导法
• 2.1.2 运用于水稻悬浮细胞团转化的转基因技术
• 2.1.3 本实验的目的和意义
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株与载体
• 2.2.2 植物材料
• 2.2.3 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 悬浮细胞团的获得
• 2.3.2 转化
• 2.3.3 GUS活性检测与抗性愈伤筛选
• 2.3.4 细胞团分化
• 2.3.5 抗性愈伤再生
• 2.3.6 转化植株PCR鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 头孢霉素和羧苄青霉素的抑菌效果
• 2.4.2 不同转化方式对转化效率的影响
• 2.4.3 不同分化培养基的分化效率
• 2.4.4 转基因植株的PCR检测
• 2.5 讨论
• 第3章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 图版