人脂肪间充质干细胞治疗糖尿病肾病大鼠的研究

论文摘要

目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病常见的并发症,是终末期肾病（ESRD）的主要原因之一。临床上对于临床糖尿病肾病尚缺乏有效治疗方法。成体干细胞（Adult stem cells , ASC）具有干细胞自我更新及多向分化的能力的共性优点,而且与胚胎干细胞相比具有获取容易、致瘤风险低、伦理学争议少等优势,是目前最具有临床应用前景的干细胞。研究证实成体干细胞可以减轻肾脏损伤、促进肾脏细胞再生修复,但对DN治疗的研究较少,且研究结果因DN模型建立方式不同,治疗的效果也不同。本研究拟建立Ⅰ型DN大鼠模型,观察人脂肪来源的间充质干细胞（human Adipose-derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs）对大鼠糖尿病肾病的治疗作用及可能机制。方法:1、动物模型建立:雄性SD大鼠,行右肾单肾切除,2周后腹腔注射链脲菌素（STZ）（65mg/kg）。1、2、4周测血糖,以血糖>16.7mmol/L作为造模成功的标准筛选1型糖尿病大鼠,4周后每天给予鱼精蛋白锌胰岛素皮下注射2-4IU,维持血糖在16.7-33.3mmol/L范围。自造模之日起,每2周检测体重变化,每4周检测血糖及24h尿蛋白定量变化;2、实验分组:①单纯单肾切除组（NX）;②DN大鼠空白治疗组（NX+STZ）;③hAD-MSCs治疗组（ NX+STZ+hAD-MSCs）。3、hAD-MSCs治疗:自STZ注射后12周时开始对NX+STZ+hAD-MSCs组大鼠经尾静脉注射hAD-MSCs,剂量5×106个;NX+STZ组经尾静脉注射等体积PBS溶液,4周1次,连续5次。4、评价指标:①自注射STZ始,32周为实验终点;②取肾脏,计算肾脏/体重比值;部分肾、胰腺组织迅速置于液氮,行分子生物学检测;部分肾组织OCT包埋置于液氮保存,行冰冻切片,部分肾组织和胰腺中性福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片;③显微镜下观察各组大鼠胰岛的形态学改变,石蜡切片通过双重免疫荧光和激光共聚焦技术观察胰岛胰岛素和胰高血糖素的表达。肾组织石蜡切片行PAS染色,观察病理变化并行半定量评分,冰冻切片行免疫荧光法观察足细胞标志物synaptopodin表达。④western blot观察synaptopodin表达。⑤观察干细胞定植,应用Hochest及CFSE两种荧光标记hAD-MSCs后行尾静脉注射,注射后于1h、2h、4h、6h、12h、48h至七天取大鼠肾脏、心脏、肺、肝脏、脾脏经冰冻切片后于共聚焦显微镜下观察hAD-MSCs定植情况。结果:1.利用STZ注射联合单肾切除的方法成功制备了糖尿病肾病大鼠模型: 32周DN大鼠与同龄单肾切除大鼠相比,体重下降（577.9±60.6g,429.1±44.7g）,尿蛋白显著升高（41.6±19.3mg, 369.4±193.6mg）,肾脏/体重比值显著增大(4.11±0. 68×10-3,10.63±3.86×10-3),肾脏病理表现为肾小球肥大、系膜基质增多、肾小球硬化、肾小管上皮细胞空泡变性、蛋白管型形成、肾小管扩张、局灶肾小管萎缩及炎细胞的浸润、足细胞标志物synaptopodin的表达明显减少等损伤,胰腺病理表现为胰岛萎缩且数量减少。2.干细胞治疗对DN和胰腺损伤的疗效评价:①与NX+STZ组相比,NX+STZ+hAD-MSCs组血糖无明显变化（34.1±5.6 mmol/L ,30.8±7.4 mmol/L）,应用胰岛素的剂量无差异。NX+STZ+hAD-MSCs组与NX+STZ组胰岛素表达无显著差异。②NX+STZ+hAD-MSCs组24h尿蛋白定量较NX+STZ组明显降低（369.44±193.65 mg,156.12±85.92mg）（P<0.05）,③肾脏/体重比值显著下降(10.63±3.86×10-3,8.01±2.39×10-3)（P<0.05）,肾小球丝球体平均截面积减小（20.07±2.58μm2×103,16.33±2.11μm2×103）（P<0.05）,肾间质炎细胞浸润及纤维化面积减少（4.80±1.81%,2.32±0.84%）（P<0.05）,肾损伤指数显著降低,④免疫荧光及western blot检测均显示足细胞synaptopodin表达上调。3.示踪结果:移植hAD-MSCs后自1h至48h可在大鼠肺、脾脏、肾脏及胰腺观察到少量hAD-MSCs定植,48h后未在大鼠组织中找到标记的细胞。结论:本研究建立了稳定、症状明显的大鼠Ⅰ型糖尿病导致的糖尿病肾病模型;多次静脉注射hAD-MSCs可明显减轻糖尿病大鼠尿蛋白,减轻肾小球肥大、足细胞损伤,减少间质炎细胞浸润及间质纤维化,hAD-MSCs对肾脏的保护作用与干细胞定植分化及血糖无关。

论文目录

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• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
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• 致谢