小麦ramosa基因的克隆及表达分析

论文摘要

小麦(Triticum aestivum)作为重要的粮食作物之一,其产量直接受花序结构的影响,因此对小麦花序建成进行研究有着重要意义。穗分枝小麦的分枝穗(branched spike)通过主穗轴节上形成支穗轴着生更多小穗,从而增加了小穗数和穗粒数。穗分枝现象的研究不仅有利于阐明小麦穗形态发育,而且能够应用于小麦的丰产育种。玉米的RAMOSA通路参与穗部形态发育的调控,决定了穗分生组织的分化。小麦中是否存在ramosa同源基因,是否存在同玉米类似的RAMOSA调控通路,这对于小麦穗部形态建成机制的研究具有深远意义。为了进一步阐明小麦穗分枝现象与RAMOSA通路之间的关系,本论文取得了以下结果:1.大田统计结果表明,分33小麦的平均株高76.9cm,穗长13.3 cm,穗分枝数为11个,每穗着粒数118。较其他品种具有良好的穗部特点。扫描电镜结果显示,分33及中国春的幼穗生长锥在发育前期表型一致,在从小花分化期向雌雄蕊分化期转变过程中分33主穗的中下部比普通小麦多分化出一级原基,从而产生多小穗的形态变异。2.克隆到了4个小麦品种中ra3基因的同源片段,并在分33的ra3基因中发现一类特有的变异,推测这一基因突变极有可能是产生穗分枝表型的原因之一。3.小麦ra3基因推导的氨基酸序列同源搜索表明,小麦RA3属于HAD超家族成员,包含TPP酶结构域。同源分析表明,其与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、狗尾草(Setaria viridis)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghum bicolor)等5种禾本科植物RA3有显著的序列相似性(68%、67%、65%、64%和67%)。4.原位杂交结果显示,小麦ra2 mRNA及ra3 mRNA都在小穗顶部生长锥附近有较高表达量,表明ra2、ra3与小麦穗部发育有着密切的关系,极有可能是参与和控制穗形态建成的关键基因。5.构建了含有Ubi启动子和bar筛选基因的pAHC25和pBI121两套用于小麦ramosa基因RNA干涉的高效表达载体,为下一步转基因实验提供了有效工具。综上所述,小麦RA3可能在穗形态建成、糖信号转导和水分胁迫抵御等过程中发挥重要作用,本研究为最终阐明小麦穗分枝机理并将其用于小麦高产的分子育种奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦穗形态发育模式及变异类型研究现状
• 1.2 玉米ramosa 基因通路研究
• 1.3 小麦基因克隆研究
• 1.3.1 同源克隆
• 1.3.2 图位克隆
• 1.3.3 抑制性差减杂交
• 1.3.4 mRNA 差异显示
• 1.4 原位杂交技术研究
• 1.4.1 RNA 原位杂交的基本原理
• 1.4.2 RNA 原位杂交在植物基因表达中的应用
• 1.4.3 RNA 原位杂交操作注意事项
• 1.5 转基因沉默技术研究
• 1.5.1 小麦转基因的方法
• 1.5.2 RNA 干涉
• 1.5.3 小麦转基因的影响因素
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 小麦分33 及中国春的形态学特征分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试小麦品种
• 2.1.2 主要试剂及其配制
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大田观察
• 2.2.2 扫描电镜观察
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 大田观察
• 2.3.2 扫描电镜观察
• 2.3.3 小麦穗分枝模式
• 2.4 讨论
• 第三章 小麦ra3 基因的同源克隆
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 宿主菌、克隆载体及分子生物学试剂
• 3.1.3 主要培养基及试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 RNA 的提取和cDNA 第一链的合成
• 3.2.2 小麦ra3 基因克隆
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 小麦ra3 基因的扩增及序列分析
• 3.3.2 小麦RA3 的进化分析
• 3.4 讨论
• 第四章 小麦ra3 基因的原核表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 目标基因
• 4.1.2 宿主菌、表达载体及分子生物学试剂
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组表达载体的构建与鉴定
• 4.2.2 重组子的诱导表达
• 4.2.3 表达产物的可溶性分析及亲和纯化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组表达载体的鉴定
• 4.3.2 SDS-PAGE 分析
• 4.4 讨论
• 第五章 ramosa 基因的原位杂交分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 供试小麦
• 5.1.2 分子生物学试剂
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 主要仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 组织切片的制备
• 5.2.2 RNA 探针合成
• 5.2.3 预杂交
• 5.2.4 杂交
• 5.2.5 杂交后洗涤
• 5.2.6 染色检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 转录产物电泳检测
• 5.3.2 探针的半定量检测
• 5.4 讨论
• 第六章 小麦ramosa 基因表达载体的构建
• 6.1 材料
• 6.1.1 目标基因
• 6.1.2 宿主菌与载体
• 6.1.3 主要试剂
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 RNAi 中间载体的构建
• 6.2.2 RNAi 表达载体的构建
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 中间载体pKAN-ra2 及pKAN-ra3 的构建
• 6.3.2 表达载体pAHC-ra2 及pAHC-ra3 的构建
• 6.3.3 表达载体pBI-Ubi-ra2 及pBI-Ubi-ra3 的构建
• 6.4 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介