大麦条纹花叶病毒中国株基因组克隆分析和编码蛋白相互作用研究

论文摘要

大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus, BSMV）是大麦病毒属（Hordeivirus）的代表成员。由于能种子传毒,该病毒曾在世界范围内广泛分布,在我国的新疆等地也曾大面积流行过,并传播到全国各地,一度给农业生产带来巨大经济损失。因此,研究BSMV的株系多样性、病毒编码蛋白之间的相互作用以及病毒与寄主相互作用,对探索新型防治措施来控制植物病毒病害具有重要意义。国内外研究者对BSMV生物学特性和分子生物学特性进行了大量的研究。自1986年Gustafson第一次报道BSMV典型株的RNA全序列后,研究者先后报道了ND18、CV17、CV42株系的全序列,而在我国1989年彭学贤等报道了新疆株的RNA 5`帽子结构和RNA2的3`和5`端序列之后,再没有关于我国发现的BSMV序列的报道。2004年,我们在北京郊区采样时发现了类似BSMV引起的大麦感病植株,采集感病植株的叶子带回室内进行病原的生物学和血清学初步鉴定。然后,我们根据已报道的BSMV序列设计引物,用RT-PCR的方法扩增出我们分离到的BSMV基因组全长,对其进行了克隆、测序和序列对比分析。为了能够获得高特异性的抗血清,进一步研究病毒蛋白的功能及与病毒相互作用的寄主植物蛋白的功能。我们用已经获得到BSMV RNAβ的cDNA为模板,PCR扩增BSMV的外壳蛋白,构建原核表达载体。优化表达条件后,进行表达、分离,以获得的蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。酵母双杂交系统（YTHS）是Fields等建立的一种灵敏的检测酵母细胞蛋白-蛋白互作的试验方法。该系统能迅速、敏感地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作,并可快速获得目的蛋白的编码基因,已在研究疾病发病机制、细胞周期、基因调控、跨膜信号传导及药物设计等方面得到广泛应用。近年来YTHS在植物病毒粒体分子结构和装配,病毒的核酸复制、基因表达调控、介体传播的分子机制、运动模式、致病机制及编码蛋白的联系图谱等方面均有应用。为了研究BSMV编码蛋白在生理状态下的直接相互作用情况,并寻找与BSMV病毒编码蛋白相互作用的寄主因子,我们自获得的BSMV基因组cDNA中PCR扩增出BSMV编码的7个蛋白基因,分别克隆到YTHS的GBKT7和GADT7载体上,利用YTHS对蛋白间的作用进行了探索。同时,构建BSMV诱导大麦叶片的cDNA文库,用酵母双杂交筛选与病毒编码蛋白相互作用的寄主因子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 大麦条纹花叶病毒研究进展
• 1.2 植物病毒侵染性克隆构建策略
• 1.3 酵母双杂交系统研究进展
• 1.4 酵母双杂交在植物病毒学研究中的应用
• 1.5 本研究的目的及意义
• 1.6 研究思路和技术路线
• 第二章大麦条纹花叶病毒中国株的鉴定和全基因组序列克隆分析
• 2.1 材料方法
• 2.2 结果分析
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 BSMV-CH 外壳蛋白的原核表达和抗血清制备
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 大麦条纹花叶病毒中国株编码蛋白之间的相互作用
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果分析
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 大麦条纹花叶病毒诱导大麦 CDNA 文库的构建及筛选
• 5.1 材料方法
• 5.2 结果分析
• 5.3 结论与讨论
• 第六章 大麦条纹花叶病毒侵染性克隆的构建和侵染分析
• 6.1 材料方法
• 6.2 结果分析
• 6.3 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录文中用到的基本分子生物学技术