不结球白菜维生素C合成代谢相关基因GLDH和AO功能的初步鉴定

论文摘要

植物中维生素C（vitamin C）又名L-抗坏血酸（L-ascorbic acid,AsA）,不仅对于植物自身的抗氧化系统、光合保护以及调节生长发育等具有非常重要的生理功能,更为人类提供了丰富而方便的Vc源（人类不能依靠自身合成和贮存AsA,需要从食物中摄取）。通过调控植物抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的表达,可以提高抗坏血酸的含量,改变某些代谢酶类的活性,从而增加植物产品的营养价值,增强植物对逆境的抗性。本研究旨在利用转基因技术初步鉴定抗坏血酸合成代谢相关基因GLDH和AO的功能,评价转基因调控抗坏血酸代谢的效果,并获得具有应用潜力的高含量抗坏血酸的不结球白菜材料。1.以4个不结球白菜品种为试材,对外植体、苗龄、激素的组配、培养基中琼脂和AgNO3浓度等再生因素进行了筛选优化,并探讨了抗坏血酸（AsA）对不结球白菜不定芽分化的影响。结果显示:以4～7 d苗龄的带柄子叶为外植体诱导不定芽效果较好;MN培养基中4 mg/L 6-BA与0.5 mg/L NAA的搭配有利于不定芽形成;琼脂的浓度变化对不定芽分化影响较大,以9 g/L琼脂为宜;培养基中添加5～7.5 mg/L的AgNO3,0.1～0.5mmol/L的AsA可显著提高不定芽的发生频率和质量。通过不定芽继代培养,生根培养和驯化移栽建立了能够获得较高再生频率的不结球白菜离体再生体系。2.L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（GLDH）为催化植物体内Vc生物合成的关键酶。本实验从不结球白菜中克隆GLDH基因的cDNA完整编码区序列用来构建植物过量表达载体,以根癌农杆菌介导法转化乌塌菜。通过组织培养共获得46株再生植株,其中9株经PCR检测为转基因植株,对转基因植株进行荧光定量PCR检测和Vc含量测定,结果表明:目的基因已经整合到乌塌菜基因组中;转基因植株的GLDH基因表达量最高为对照的28.5倍;Vc含量比对照植株增高,个别株系增高约1.8倍。3.根据植物中hpRNA（hairpinRNA）原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计一对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’的叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过三次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定后,插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,通过农杆菌介导法转化乌塌菜。现已获得转基因植株5株,为深入研究GLDH基因功能创造了条件。4.以不结球白菜品种’苏州青’为实验材料,采用RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜抗坏血酸氧化酶基因（ascorbate oxidase,AO）的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因全长1854 bp,编码577个氨基酸,推测的分子量64.28 kD,等电点（pI）9.07,与其它植物的AO蛋白具有较高的相似性。序列比对和系统进化分析表明,该基因在不同物种之间具有较高保守性,与芥菜型油菜和拟南芥亲缘关系最近。将该基因提交GenBank,登录号为AB369266。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于2个。荧光定量PCR检测表明,该基因有低水平的组成型表达,在黑霉病诱导后72 h其表达量达到最高峰。AO在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1 植物抗坏血酸的研究进展
• 1.1 抗坏血酸的生物学功能
• 1.1.1 作为抗氧化剂保护植物体免受氧化损伤
• 1.1.2 抗坏血酸在细胞壁代谢和细胞膨大中的作用
• 1.1.3 抗坏血酸在细胞分裂和分化中的作用
• 1.1.4 抗坏血酸在光合作用和光保护中的作用
• 1.1.5 作为一些酶的辅酶和底物
• 1.2 植物抗坏血酸的生物合成
• 1.3 植物抗坏血酸的代谢
• 1.4 AsA合成代谢相关酶基因的克隆及基因调控研究
• 1.4.1 GLDH基因研究进展
• 1.4.2 AO基因研究进展
• 1.5 RNAi研究进展
• 2 芸薹属植物转基因研究进展
• 2.1 农杆菌介导法转基因
• 2.1.1 农杆菌介导遗传转化的优势
• 2.1.2 影响农杆菌介导的遗传转化的主要因素
• 2.1.2.1 农杆菌种类
• 2.1.2.2 植物基因型及外植体种类
• 2.1.2.3 转化及培养条件
• 2.1.2.4 抑制农杆菌生长的抗生素
• 2.1.2.5 转化细胞的选择
• 2.2 不结球白菜转基因研究进展
• 2.2.1 基因型对不定芽的再生的影响
• 2.2.2 外植体类型及生理状态对不定芽再生的影响
• 2.2.3 植物激素对不定芽再生的影响
• 3对不定芽再生的影响'>2.2.4 AgNO₃对不定芽再生的影响
• 第二部分 研究报告
• 第一章 不结球白菜离体培养与植株再生技术研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 无菌苗的培养
• 1.3 不定芽诱导
• 1.4 不定芽继代,生根与驯化移栽
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体对离体培养的反应
• 2.2 激素浓度对不定芽分化的影响
• 3在不定芽分化中的作用'>2.3 AgNO₃在不定芽分化中的作用
• 2.4 AsA对不定芽分化的影响
• 2.5 琼脂浓度对不定芽分化的影响
• 2.6 苗龄对不定芽诱导的影响
• 2.7 再生苗的继代、生根和移栽
• 3 讨论
• 第二章 不结球白菜GLDH基因植物过量表达载体构建及其转基因功能验证
• 1 材料和方法
• 1.1 植物过量表达载体的构建
• 1.1.1 植物材料和质粒
• 1.1.2 酶和试剂
• 1.1.3 RNA的提取
• 1.1.4 目的基因的TA克隆
• 1.1.5 植物表达载体pCAMBIA2301-GLDH构建
• 1.1.6 植物表达载体质粒转化农杆菌
• 1.1.6.1 制备农杆菌感受态
• 1.1.6.2 载体转化农杆菌
• 1.2 植物材料的培养和转化
• 1.2.1 农杆菌侵染液的准备
• 1.2.2 外植体的预培养,侵染和共培养
• 1.2.3 不定芽再生,筛选和植株形成
• 1.2.4 实验所用培养基配方
• 1.3 转基因植株的鉴定
• 1.3.1 GUS组织化学染色
• 1.3.2 DNA提取及PCR检测
• 1.3.3 荧光定量PCR检测
• 1.3.4 植株Vc含量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因的克隆
• 2.2 植物过量表达载体pCAMBIA2301-GLDH构建
• 2.3 GUS瞬时表达检测
• 2.4 转基因植株PCR鉴定
• 2.5 荧光定量PCR检测
• 2.6 转基因植株Vc含量测定
• 3 讨论
• 第三章 不结球白菜GLDH基因植物RNAi表达载体构建及其转基因功能验证
• 1 材料和方法
• 1.1 植物RNAi表达载体的构建
• 1.1.1 植物材料和质粒
• 1.1.2 酶和试剂
• 1.1.3 RNA的提取
• 1.1.4 反转录和RT-PCR
• 1.1.5 PCR产物的克隆与测序
• 1.1.6 中间载体的构建
• 1.1.7 RNAi载体的构建
• 1.1.8 植物表达载体质粒转化农杆菌
• 1.2 植物材料的培养和转化
• 1.2.1 农杆菌侵染液的准备
• 1.2.2 外植体的预培养,侵染和共培养
• 1.2.3 不定芽再生,筛选和植株形成
• 1.2.4 实验所用培养基配方
• 1.3 转基因植株的鉴定
• 1.3.1 GUS组织化学染色
• 1.3.2 DNA提取及PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 叶片总RNA的提取
• 2.2 基因的克隆与序列分析
• 2.3 重组基因的克隆与鉴定
• 2.4 GLDH基因RNAi载体的构建与鉴定
• 2.5 载体在农杆菌中的转化
• 2.6 GUS瞬时表达检测
• 2.7 转基因植株PCR鉴定
• 3 讨论
• 第四章 不结球白菜抗坏血酸氧化酶基因cDNA全长克隆及表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 各种酶类
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 常用储液
• 1.1.6 Southern杂交所需溶液及物品
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物材料的准备
• 1.2.2 基因组DNA,总RNA的提取
• 1.2.2.1 基因组DNA的提取
• 1.2.2.2 总RNA的提取
• 1.2.3 单链cDNA的合成
• 1.2.4 引物的设计
• 1.2.5 PCR扩增
• 1.2.6 3'RACE
• 1.2.7 5'RACE
• 1.2.7.1 1st Strand cDNA的合成
• 1.2.7.2 cDNA的纯化
• 1.2.7.3 cDNA的末端加尾
• 1.2.7.4 第一轮PCR反应
• 1.2.7.5 第二轮PCR反应
• 1.2.8 目的片段的回收及克隆
• 1.2.8.1 目的片段的回收
• 1.2.8.2 感受态大肠杆菌DH5α的制备
• 1.2.8.3 重组质粒的构建
• 1.2.8.4 重组质粒的转化
• 1.2.9 重组质粒的鉴定
• 1.2.10 序列测定及分析
• 1.2.11 Southern杂交分析
• 1.2.11.1 杂交探针的制备
• 1.2.11.2 DNA的提取、酶切及电泳
• 1.2.11.3 转膜
• 1.2.11.4 杂交
• 1.2.11.5 显色
• 1.2.12 荧光定量PCR检测黑霉病诱导AO转录表达
• 2 结果与分析
• 2.1 不结球白菜AO基因RT-PCR扩增
• 2.2 AO基因3'RACE和5'RACE扩增
• 2.3 不结球白菜BcAAO基因序列分析
• 2.4 不结球白菜BcAAO基因的蛋白结构特征分析
• 2.5 Southern杂交检测BcAAO基因的拷贝数
• 2.6 黑霉病诱导BcAAO基因转录表达分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 论文发表情况
• 致谢