菌丝霉素在原核细胞中的表达及产物活性检测

论文摘要

菌丝霉素是从腐生子囊菌（Pseudoplectania nigrella）的分泌蛋白中分离出来的首例真菌防御素。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸,其分子量约为4.4KDa,其空间结构为防御素典型的CSap基序。菌丝霉素对革兰氏阳性菌特别是肺炎链球菌有很强的杀菌作用,且由于其独特的杀菌机制,使菌丝霉素不具细胞毒性和溶血性等危害,因此具有很大的药用潜力和大规模生产前途。本文主要研究了菌丝霉素在大肠杆菌中高效表达的方法以及探索金属螯合亲和色谱纯化菌丝霉素的最佳纯化条件。根据NCBI GenBank中菌丝霉素成熟肽的基因序列,人工合成菌丝霉素成熟肽的DNA片段并将其保存于pPIC-9K质粒中。再根据其基因序列人工设计合成一对特异引物,以保存于pPIC-9K质粒中的菌丝霉素基因片段为模板通过PCR技术克隆扩增目的基因片段,然后正向插入pET-32a（+）表达载体中,构建pET32a（+）-Plectasin表达重组质粒。经测序分析验证重组质粒中菌丝霉素基因序列的正确性后,将pET32a（+）-Plectasin重组质粒转入大肠杆菌Rosetta（DE3）表达菌株中,用IPTG作为诱导剂对融合基因进行诱导表达。SDS-PAGE蛋白质电泳结果显示,转化菌株表达了一条大约25 KDa的融合蛋白片段,与预期Trx-Plectasin融合蛋白的大小相符,其表达量约占菌体总蛋白的50%以上。破碎细胞,分离提取融合蛋白,用Ni-IMAC金属螯合亲和色谱纯化融合蛋白,经SDS-PAGE检测后可见一条纯净的大小约为25 KDa的洗脱条带,与预期的融合蛋白大小相符。用肠激酶切割融合标签,释放出菌丝霉素成熟肽段,并检测到重组菌丝霉素对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。总之,本研究成功实现了菌丝霉素基因在原核表达系统中的高效表达,同时也摸索出提高金属螯合亲和色谱一次性纯化富含二硫键抗菌肽的纯化效率的条件,为富含二硫键的抗菌肽的基因工程生产提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩写
• 1. 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 抗菌肽研究进展
• 1.2.2 防御素研究进展
• 1.2.3 菌丝霉素Plectasin的研究进展
• 1.3 立题依据
• 1.4 研究目标和内容
• 1.4.1 研究目标
• 1.4.2 研究内容
• 1.5 技术路线
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要溶液及缓冲液的配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Plectasin基因的合成及相关引物的设计
• 2.2.2 Rosetta（DE3）/pET-32a（+）-Plectasin融合表达系统的构建
• 2.2.3 重组Plectasin基因的转化与表达
• 2.2.4 可溶性重组蛋白的分离与纯化
• 2.2.5 融合蛋白的蛋白酶切反应
• 2.2.6 金属螯合亲和层析精纯菌丝霉素
• 2.2.7 SDS-PAGE电泳和Tricine-SDS-PAGE电泳
• 2.2.8 菌丝霉素肽段的活性检测
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 含菌丝霉素基因片段的合成与克隆
• 3.2 含酶切位点Plectasin基因片段的扩增
• 3.3 pET-32a（+）质粒的双酶切
• 3.4 pET-32a（+）-Plectasin表达载体构建与克隆菌株转化分析
• 3.5 PCR检测转化子
• 3.6 Plectasin融合基因在Rosetta（DE3）中的表达
• 3.7 重组Trx-Plectasin融合基因在大肠杆菌不同表达株系中表达量的分析
• 3.8 诱导温度对融合蛋白表达形式的影响及融合蛋白的可溶性分析
• 3.9 Trx-Plectasin融合蛋白的亲和纯化
• 3.10 不同亲和树脂对蛋白质纯化的影响
• 3.11 融合蛋白的酶切反应及Tricine-SDS-PAGE检测
• 3.12 牛津杯法测定重组Plectasin的抑菌活性
• 4. 讨论
• 4.1 菌丝霉素基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中的高效表达
• 4.2 大肠杆菌中融合表达有利于重组蛋白的正确折叠
• 4.3 低温诱导提高了菌丝霉素以可溶性蛋白形式产生的比例
• 4.4 合理的优化条件是实现融合蛋白高质量纯化的保证
• 4.5 金属螯合亲和树脂的选择与融合蛋白纯度、产量密切相关
• 5. 结论与展望
• 参考文献
• 附录一
• 致谢