杉木分子细胞遗传学研究

论文摘要

分子细胞遗传学是现代细胞遗传学的发展方向。本研究运用荧光染色、染色体分带、染色体微切割、微分离微扩增和原位杂交等技术手段，对我国重要的特有的用材树种杉木，进行细胞学和分子细胞遗传学研究。 本实验对杉木的根尖有丝分裂中期染色体进行研究结果发现，利用C带能够较容易地辨认出11对中的6对染色体。而荧光分带研究的结果则为CMA带比DAPI带更适宜杉木的分带研究。CMA带在杉木染色体上有荧光带纹出现，而DAPI未见荧光带纹。 利用压片法，通过连续的采样，研究了杉木花粉母细胞减数分裂的规律。发现杉木花粉母细胞减数分裂时期与雄球花颜色变化有密切的相关关系，其颜色经历从黄褐色—翠绿色—绿色—褐色—深褐色的变化。根据对杉木末期Ⅱ四分体的观察，杉木四分体分裂方式主要是单平面分裂方式，其胞质分裂方式为同时型。 首次报道杉木花粉（小孢子）母细胞减数分裂过程中有一些异常细胞学行为的发生。单价体和多价体、染色体桥、落后染色体、不均等分离、微核等异常现象出现。杉木花粉的生活力的大小与杉木小孢子形成过程中，减数分裂是否异常有关。异常的减数分裂引起遗传物质不均衡分配，致使产生败育小孢子。 利用玻璃针法成功分离杉木染色体组具随体的单染色体，用DOP-PCR法对此染色体进行了扩增，扩增片断的大小为100-700bp的连续带。将DOP-PCR方法扩增产物克隆至pGEM-T载体，建立了随体的染色体DNA文库。利用点杂交的方式对随体染色体文库的质量进行了评价，在所得到的杉木随体单染色体DNA微克隆文库中单／低拷贝所占比例为57.1％，而中和高拷贝的占42.9％。 以28S为探针，对杉木减数分裂的花粉母细胞和有丝分裂的根尖细胞进行荧光原位杂交结果发现，在杉木减数分裂的花粉母细胞和杉木的根尖分裂细胞中，杂交的信号在分裂的间期和前期细胞中均能观察到。从杂交效果和成功率来看，利用杉木花粉母细胞分裂期的细胞片杂交效果较好。 首次以杉木的两个近缘种柳杉和水杉的基因组为探针，对杉木减数分裂的花粉母细胞和有丝分裂的根尖细胞进行基因组原位杂交（GISH）结果发现，以柳杉基因组为探针，杂交信号分布在大部分的染色体上，杂交信号在染色体上仅为强弱之分。中期染色体有4条染色体杂交信号较弱，其余染色体信号都比较强。而以水杉基因组为探针的GISH杂交，每条染色体上杂交信号基本一致，几乎没有差别。因此从细胞和分子水平上可以推测分类上同科不同属的这三个树种之间，存在较为近的系统发育关系，但水杉与杉木的亲缘关系比柳杉与杉木的亲缘关系要近。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 上篇 文献综述
• 第一章 林木细胞遗传学的研究进展
• 1.林木树种的染色体计数及倍性
• 1.1 染色体数目
• 1.2 倍性
• 2.林木细胞减数分裂研究概况
• 2.1 林木花粉小孢子母细胞的减数分裂
• 2.2 林木胚囊大孢子母细胞的减数分裂
• 2.3 减数分裂与染色体构型分析
• 3.林木染色体核型研究
• 4.林木染色体带型
• 4.1 染色体的显带技术的发展状况
• 4.2 林木染色体几种显带技术及其应用
• 第二章 林木分子遗传学研究进展
• 1.高密度遗传连锁图谱的构建的分子标记
• 1.1 RFLP标记
• 1.2 STR标记
• 1.3 EST标记
• 1.4 SNPs标记
• 2.遗传连锁图谱
• 2.1 分子标记的遗传连锁图谱
• 2.2 基因组物理图谱
• 3.从结构基因组到功能基因组分析中的细胞遗传学——比较基因组学
• 第三章 林木分子细胞遗传学研究进展
• 1.染色体微切割、微分离及微扩增
• 1.1 单染色体或染色体特定片段分离与DNA文库的建立
• 1.2 分子标记的遗传连锁图谱与染色体或染色体片段特异文库构建
• 1.3 染色体特异文库构建的应用
• 2.荧光原位杂交（FISH）
• 2.1 荧光原位杂交的原理
• 2.2 荧光原位杂交的应用
• 2.林木细胞遗传学研究在基因定位中的作用
• 2.1 rDNA（rRNA基因）的染色体定位
• 2.2 rDNA定位与染色体分带
• 下篇 杉木分子细胞遗传学研究
• 第四章 杉木根尖染色体带型研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 杉木根尖染色体C-带
• 2.2 杉木根尖染色体荧光带型
• 3.结论与讨论
• 3.1 C带在染色体组中染色体识别中的应用
• 3.2 荧光带纹在杉木染色体组分析的应用
• 3.3 杉木细胞学新标记应用的重要性
• 第五章 杉木花粉母细胞减数分裂及其进程的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 杉木减数分裂过程中外部形态变化
• 2.2 杉木花粉母细胞（PMCs）减数分裂进程及染色体行为
• 2.3 杉木雄球花外部形态变化与减数分裂时期的关系
• 3.结论与讨论
• 3.1 杉木花粉母细胞减数分裂时期与雄球花外部形态特征
• 3.2 杉木花粉母细胞减数分裂进程与小孢子形成
• 第六章 杉木花粉母细胞减数分裂的细胞学特性
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 固定与保存
• 1.2.2 制片方法
• 1.2.3 荧光染色
• 2 结果与分析
• 2.1 杉木花粉母细胞减数分裂中的染色体的荧光带纹
• 2.2 不同杉木变异类型雄球花外部形态比较
• 2.3 不同杉木变异类型染色体荧光带纹的比较
• 2.4 减数分裂中异常现象的发生
• 3 结论与讨论
• 3.1 荧光带纹在减数分裂染色体研究中的应用
• 3.2 减数分裂末期Ⅱ细胞学行为的多样性
• 3.3 减数分裂的异常与孢子的育性
• 3.4 减数分裂异常的可能原因
• 第七章 杉木单染色体的微切割、微分离及微扩增
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 杉木随体染色体的微分离
• 2.2 随体染色体的体外PCR扩增
• 2.3 Southern杂交分析
• 2.4 单染色体文库的分析
• 2.5 DOP-PCR产物的序列测定
• 3.讨论
• 3.1 染色体微切割、微扩增过程中的污染问题
• 3.2 微扩增片段大小的影响因素
• 3.3 杉木随体单染色体DNA文库的质量
• 3.4 杉木随体染色体文库序列的测定
• 第八章 杉木28S rDNA基因的荧光原位杂交定位
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 杉木28SrDNA PCR扩增
• 2.2 FISH效果的影响因素
• 2.3 杉木花粉母细胞减数分裂染色体28S rDNA基因的荧光原位杂交定位
• 2.4 杉木根尖细胞染色体28S rDNA基因的荧光原位杂交定位
• 3 结论与讨论
• 3.1 杉木28SrDNA序列
• 3.2 28S rDNA在杉木花粉母细胞减数分裂中细胞的定位
• 3.3 28SrDNA在杉木根尖有丝分裂细胞的定位
• 3.4 28SrDNA在杉木花粉母细胞减数分裂中细胞的定位与在根尖有丝分裂细胞的定位的比较
• 第九章 杉木与其近缘种之间荧光原位杂交的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 柳杉和水杉基因组总DNA剪切:高压灭菌法与超声波破碎法
• 2.2 以柳杉基因组为探针与杉木进行的GISH杂交
• 2.3 以水杉基因组为探针与杉木进行的GISH杂交
• 3.结论与讨论
• 3.1 GISH的实用性和分辨率
• 3.2 柳杉和水杉总基因组DNA的剪切
• 3.3 染色体荧光原位杂交技术与林木近缘种亲缘关系
• 第十章 结论与讨论
• 10.1 主要研究结论
• 10.2 存在问题和进一步研究方向
• 10.2.1 细胞学研究方面
• 10.2.2 分子细胞遗传学方面
• 参考文献
• 详细摘要