脐带源间充质干细胞移植对肝纤维化及肝硬化大鼠肝星状细胞增殖与胶原代谢的影响

论文摘要

肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是肝脏对慢性炎症、坏死或其他损伤的修复反应，肝硬化（liver cirrhosis, LC）则是肝纤维化的终末结局。其主要特征是以胶原为主的细胞外间质（extracellular matrix, ECM）合成增多，降解减少，从而引起ECM过度沉积。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是肝脏合成ECM的主要来源细胞，HSCs经过活化、增殖、黏附和迁移等过程，表达多种信号转导蛋白，合成大量以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM成分和细胞因子，是肝纤维化形成的中心环节。因此，抑制HSCs活化及相关的胶原代谢成为治疗肝纤维化及肝硬化的靶点所在。目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效方法，但由于肝源紧张、免疫排斥等原因限制了肝移植的临床应用。因此亟待寻找新的有效治疗方法。近年来，随着干细胞移植技术在肝脏疾病治疗中的应用，更由于其具有来源丰富、低免疫原性、创伤性小、操作简单等优点，已成为肝脏疾病治疗的重要手段，使肝脏疾病的再生治疗进入一个划时代阶段。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，广泛存在于骨髓、脐带组织、脐血、外周血及脂肪等组织中。MSCs易于提取，免疫原性低，并且具有免疫抑制作用，避免了肝移植的肝源紧张、移植后免疫排斥等不足，被认为是目前最具治疗潜力的供体细胞。有研究证实骨髓源MSCs（bone marrow-derived MSCs,BM-MSCs）可以抑制HSCs的活化，促使HSCs凋亡，减少ECM的生成，降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量，从而改善肝纤维化和肝硬化。而对于作为极佳的MSCs来源的人脐带源MSCs（human umbilical cord-derived MSCs,hUC-MSCs）移植治疗肝纤维化及肝硬化的研究并不多。为此，我们构建大鼠肝纤维化及肝硬化模型，经尾静脉注射hUC-MSCs，探讨hUC-MSCs移植对大鼠肝纤维化和肝硬化的治疗作用，以期为临床治疗肝纤维化及肝硬化提供实验和理论依据。目的：研究hUC-MSCs移植对大鼠肝纤维化和肝硬化的治疗作用及在此过程中HSCs的作用及其机制。方法：将120只雄性Wistar大鼠随机分成以下几组：正常对照组：CCl4/saline0wk；模型组（肝纤维化模型组：CCl4/saline4wks，5wks，7wks；肝硬化模型组：CCl4/saline8wks,10wks,14wks）；MSCs移植组（肝纤维化MSCs移植组：CCl4/MSCs0wk,1wk,2wks,4wks；肝硬化MSCs移植组：CCl4/MSCs0wk,2wks,4wks,8wks），每组8只。采用浓度40%CCl4橄榄油溶液，按2ml/kg体重的剂量，给予四肢轮流皮下注射，每周2次；造模成功后模型组及治疗组继续每周2次皮下注射CCl4，直至处死。MSCs移植肝纤维化组与MSCs移植肝硬化组分别于造模成功后（即CCl4注射第4周和第7周）经尾静脉注射hUC-MSCs，剂量为5×106个/只，并分别于注射后第1、2、4周和第2、4、8周处死大鼠并取材。应用血清学检测方法检测大鼠ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL，观察hUC-MSCs移植对大鼠肝功能的影响；采用Haematoxylin and eosinstaining（H&E染色）、Sirius red staining（天狼猩红染色）检测肝组织病理改变；采用免疫组织化学染色检测α-SMA蛋白在大鼠肝组织中的表达；采用免疫组织化学染色、Western blot和real-time Q-PCR方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1蛋白与mRNA在大鼠肝组织中的表达。结果：①H&E、天狼猩红染色结果显示：CCl4诱导的大鼠肝纤维化和肝硬化模型成功建立，模型组随给药时间的延长，肝细胞变性坏死及肝内纤维组织沉积逐渐增多；与模型组相比，MSCs移植组肝细胞变性坏死有所减少，HE炎症评分、纤维组织沉积定量分析结果显示：除肝纤维化CCl4/MSCs1wk组与肝纤维化模型CCl4/saline4wks组相比无明显降低外，肝纤维化CCl4/MSCs2wks组、4wks组及肝硬化MSCs移植各组均显示存在显著性差异；②血清学检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，CCl4/MSCs1wk组肝功能较肝纤维化模型组无明显改善，CCl4/MSCs2wks组ALT、AST较模型组显著降低，ALB、TBIL、DBIL无明显改善，肝硬化CCl4/MSCs2wks组中的ALB较肝硬化模型组无明显升高，其余各个时间点MSCs移植组较模型组的肝功能明显好转。③正常对照组大鼠肝组织中，α-SMA仅在血管壁平滑肌细胞有表达，表达含量低，这提示仅有少量活化的HSCs。CCl4造模后，α-SMA在汇管区表达，这表明HSCs被大量活化。模型组大鼠肝组织α-SMA的累积阳性光密度值均显著高于对照组，P<0.01。hUC-MSCs移植后，MSCs移植组肝脏组织中α-SMA的表达水平除肝纤维化CCl4/MSCs1wk组与肝纤维化模型CCl4/saline4wks组相比无明显减少外，其余肝纤维化CCl4/MSCs2wks组、4wks组及肝硬化MSCs移植各组较模型组均显著降低，而肝纤维化MSCs移植组及肝硬化MSCs移植组组内，随着MSCs移植时间的延长，α-SMA阳性的细胞也逐渐增多。④免疫组织化学染色显示：正常对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1蛋白阳性细胞在汇管区少量表达；随造模时间的延长，模型组和MSCs移植组中均可见Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1阳性表达细胞逐渐增多。注射相同时间CCl4后，与模型组相比，MSCs移植组MMP-13蛋白阳性细胞明显增多，Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP-1蛋白阳性细胞明显减少。⑤应用Western blot技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1蛋白在各组大鼠肝组织中的表达，结果显示，hUC-MSCs移植后，MSCs组肝脏组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1蛋白表达水平除肝纤维化CCl4/MSCs1wk组与肝纤维化模型CCl4/saline4wks组相比无统计学差异外，其余肝纤维化CCl4/MSCs2wks组、4wks组及肝硬化MSCs移植各组较模型组均具有显著性差异，MMP-13蛋白表达水平明显升高，Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP-1蛋白表达水平明显降低。⑥应用实时荧光定量PCR，采用相对定量2-△△Ct法比较Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA、MMP-13mRNA、TIMP-1mRNA在各组大鼠肝组织中的表达，结果显示，hUC-MSCs移植后，MSCs移植组肝脏组织中Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA、MMP-13mRNA及TIMP-1mRNA表达水平除肝纤维化CCl4/MSCs1wk组与肝纤维化模型CCl4/saline4wks组相比无统计学差异外，其余肝纤维化CCl4/MSCs2wks组、4wks组及肝硬化MSCs移植各组较模型组均具有显著性差异，MMP-13mRNA表达水平明显升高，Ⅰ型胶原mRNA、Ⅲ型胶原mRNA、TIMP-1mRNA表达水平明显降低。结论：MSCs移植能够改善肝纤维化，肝硬化大鼠的肝功能，减少肝组织中α-SMA的表达，抑制HSCs的增殖活化，并明显降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量；MSCs通过上调MMP-13表达，下调TIMP-1表达，对肝纤维化及肝硬化起到治疗作用；MSCs移植后在体内发挥作用需要一个阶段，在致病因素持续存在的情况下，MSCs移植并不能逆转肝纤维化或者肝硬化，只能延缓肝纤维化或肝硬化的进程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 间充质干细胞移植治疗肝纤维化的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历