城市水体中新型病原细菌生态学特征及其溯源研究

论文摘要

城市水体中病原微生物潜在生物污染风险,危害人群健康,已引起广泛关注,但是对城市水体中病原微生物的了解仍十分有限。本论文利用分子生物学技术、生物信息技术、细菌分离鉴定技术以及数学分析方法,对城市水体中的主要病原菌的生态学特征,包括病原微生物群落的生物多样性、病原微生物种群结构、时空分布特点进行了系统的研究;对城市污水受纳水体中主要病原菌,特别是优势种群—致病性弓形杆菌（Arcobacter）进行了溯源分析,评估了现有污水处理工艺对城市污水中主要病原菌去除效果,既为城市水体中病原微生物污染控制提供基础数据,也为源头控制致病性弓形杆菌传播奠定了基础。本论文包括以下主要研究内容和结论:（1）提取水体中微生物总DNA,利用PCR扩增水体细菌的16SrDNA基因片段,构建了16S rDNA基因文库,对基因文库中的克隆测序后进行序列比对,进而分析水体细菌种群结构。镇江市城市受纳水体—内江中细菌分属9大细菌类群,本研究采用的分子生物学方法较为充分地体现了水体中细菌种群的多样性,存在现行水质生物监测指标以外的多种新型病原菌。其中,变形菌（Proteobacteria）为主要细菌类群,Arcobacter为优势菌群,占总检测样品的76.8%,推测其来源于城市污水。（2）内江水体中主要病原菌生物活性研究。根据水样中16S rDNA分析结果,采用传统的细菌分离鉴定方法,并通过生理生化指标和细菌16S rDNA序列分析,分离并鉴定了11株分别属于产碱杆菌、气单胞菌、变形菌、不动杆菌等变形菌群的Beta和Gamma亚群的细菌。采用23S rDNA上Arcobacter种属特异性引物,通过PCR扩增技术分析了内江水体中致病性Arcobacter的活性,证明水体中致病性Arcobacter具有潜在的增殖能力。上述结果表明:内江水体中主要病原菌具有生物学活性。（3）对内江水体微生物逐级构建的16S rDNA基因文库,采用多样性估算指数SACE和SChaol进行计算,两者之一达到稳定或两者同时达到稳定时基因库中的克隆数作为全面反映细菌种群多样性的最小库容值。当构建的内江水体16S rDNA基因文库中测序克隆数约为100个时多样性估算达到最大值。（4）利用本研究建立的水体中细菌群落结构分析方法,对内江水体中细菌种群结构、主要病原微生物的时空分布特征研究发现,不同区域位置水体中细菌类群的总体结构没有明显差异,均以变形菌类群为水中的主要菌群;致病性Arcobacter为水体中的优势菌群,Arcobacter cryaerophilus所占比例最高。在水体不同区域主要的病原细菌的组成与城市污水溢流口的方位和距离有关,推测内江水体中主要病原微生物来源于城市污水。（5）通过细菌时空分布特征和主要病原菌的生物信息学分析,证明内江水体中微生物种群结构与污水处理厂出水中种群结构相同;内江水体中主要病原菌来源于城市污水,优势细菌菌群Arcobacter主要来自医院污水和居民区生活污水;Trichococcus pasteuri主要来自城市污水中的医院污水;梭菌（Clostridium）则主要来自城市污水中的菜场污水和医院污水;内江水体中其他来自城市污水中的病原菌则与不同来源处的城市污水无明显关系。（6）以污水处理厂进水水样和污水处理工艺Ⅰ和处理工艺Ⅱ处理后的出水为研究对象,利用分子生物学技术和生物学信息学技术对水体中的细菌种群进行了分析。两种污水处理工艺对细菌群落的组成没有明显改变,但处理工艺Ⅰ对部分主要的病原菌均有明显的消减作用,存在种属差异,并且对优势种群Arcobacter cryaerophilus的控制效果与处理水温有明显关系,推测工艺Ⅰ对Arcobacter cryaerophilus消减作用主要是通过吸附沉淀作用实现的;处理工艺Ⅱ中紫外消毒能有效地消减优势种群Arcobacter cryaerophilus以外的其他病原菌,表明优势种群Arcobacter cryaerophilus对紫外线作用不敏感。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 水环境病原微生物污染及其危害
• 1.1.1 病原微生物污染的来源
• 1.1.2 水环境中主要常见病原微生物
• 1.1.3 水环境中新型病原微生物
• 1.1.4 病原微生物污染的危害
• 1.2 水环境病原微生物污染控制标准
• 1.3 水处理工艺对病原微生物去除的措施
• 1.4 研究问题的提出
• 1.5 分子生物学在环境微生物领域的应用
• 1.5.1 现代分子生物学检测微生物主要方法与技术
• 1.5.2 检测环境微生物分子生物学方法面临的问题
• 1.5.3 16S rDNA克隆文库的构建
• 1.5.4 16S rDNA克隆文库的分析
• 1.6 研究区域简介
• 1.7 本文的研究内容
• 第2章 内江水体细菌16S rRNA基因文库的建立及分析
• 2.1 试验材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果与分析
• 2.2.1 细菌基因组DNA的提取和纯化
• 2.2.2 16S rRNA基因的PCR扩增
• 2.2.3 16S rDNA阳性克隆鉴定
• 2.2.4 内江水体细菌微生物群落分析
• 2.2.5 内江水体中主要病原微生物种属
• 2.3 讨论
• 第3章 基子16S rDNA分析的内江水体中主要病原细菌的分离和鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 水样
• 3.1.2 分离培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 分离纯化
• 3.2.2 菌落及菌属形态特征观察
• 3.2.3 以16S rRNA基因为指标的菌种分类与鉴定
• 3.2.4 溶血性检查
• 3.2.5 敏感性实验
• 3.2.6 其他生理生化实验
• 3.2.7 致病性Arcobacter的分子生物学活性检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 菌落特征和菌体形态
• 3.3.2 基于16S rDNA的分类与鉴定
• 3.3.3 溶血性
• 3.3.5 基于生理生化的鉴定
• 3.3.6 其他基于16S rDNA鉴定的分离菌株
• 3.3.7 致病性Arcobacter sp.的活性检测结果
• 3.4 讨论
• 第4章 16S rDNA分析内江细菌多样性的最佳克隆库容实验及理论研究
• 4.1 试验材料和方法
• 4.1.1 水样的采集和处理
• 4.1.2 试验材料和分子生物学操作
• 4.1.3 16S rDNA克隆文库的分析方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同克隆文库库容的内江水体中微生物群落结构分析
• 4.2.2 内江水体微生物多样性的统计学方法分析
• 4.2.3 反映区域水体细菌多样性的最佳测序克隆库容
• 4.3 讨论
• 第5章 内江水体细菌群落结构特征研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 采样点
• 5.1.2 试验材料和分子操作方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 内江不同区域位置水体中微生物群落结构特征分析
• 5.2.2 内江水体中主要细菌群的地理分布特征
• 5.2.3 内江水体中主要细菌群落的时间分布特征
• 5.2.4 内江水体中主要细菌群落时空分布特征差异分析
• 5.2.5 内江不同区域位置水体中主要病原细菌之间关系
• 5.2.6 内江水体中致病性Arcobacter生物信息学分析
• 5.3 讨论
• 第6章 内江水体中主要病原菌的溯源研究
• 6.1 试验材料与方法
• 6.1.1 分析水样来源
• 6.1.2 分子实验操作方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 污水处理厂出水微生物群落分析
• 6.2.2 不同来源城市污水中细菌群落结构分析
• 6.2.3 不同来源城市污水中主要细菌种群的时空分布特征分析
• 6.2.4 内江与不同来源城市污水中主要病原菌之间的关系
• 6.2.5 内江与城市污水中主要病原菌生物信息学分析
• 6.3 讨论
• 第7章 污水处理工艺对病原微生物去除效果
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 水样采集
• 7.1.2 试验材料与分子生物学操作
• 7.1.3 污水处理技术工艺
• 7.2 结果
• 7.2.1 污水处理厂进水水样中微生物群落分析
• 7.2.2 污水处理工艺Ⅰ对主要细菌种群结构的影响
• 7.2.3 污水处理工艺Ⅱ对主要病原微生物种结构的影响
• 7.2.4 不同处理工艺对污水细菌克隆数的影响
• 7.2.5 两种处理工艺对微生物种群结构影响的相关性分析
• 7.4 讨论
• 第8章 结论与展望
• 8.1 主要研究内容与结论
• 8.2 创新点
• 8.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 读博期间相关科研成果
• 一、攻读博士学位期间发表的论文
• 二、申请和授权专利
• 三、攻读博士学位期间参加的科研项目
• 附录
• Ⅰ 缩略语表
• Ⅱ 主要实验仪器
• Ⅲ 主要试剂及配制
• Ⅳ 软件计算中导入的文本数据