湘杂棉SSR指纹图谱构建及种子纯度检测的研究

论文摘要

本文利用SSR分子标记方法对长江流域大面积推广种植的湘杂棉系列及其中部分湘杂棉亲本材料进行研究。建立了一套简便,快捷,准确可靠的分子技术鉴定体系;筛选出了一批在湘杂棉及其亲本上具有较高多态性的SSR引物,构建出了湘杂棉系列品种的指纹图谱;并将其应用于湘杂棉种子纯度的检测和未知种身份的识别。研究主要结果如下:1.适应于棉花的SSR扩增体系的建立:反应总体积为10μl,其中含有Mg2+（25mM）0.4μl,dNTPs（10mM）0.2μl,上下游引物（10μM）各0.6μl,TaqDNA聚合酶（1U/μ1）0.5μl,10×Reaction buffer 1.0μl,模板DNA（50ng/μl）0.5μl,ddH2O6.2μl;采用8%聚丙烯酰胺电泳,稳压180V,70分钟;采用改进银染法染色。2.湘杂棉指纹图谱的构建:本实验从棉花26对染色体上挑选了331对SSR引物进行筛选,其中有31对在实验材料中显示多态性,占检测引物的9.37%。从31对引物中挑出19对多态性较好、条带易读取的引物,构建了湘杂棉指纹图谱。3.湘杂棉种子纯度的检测:利用单重PCR和双重PCR分别对湘杂棉2号和湘杂棉6号进行纯度检测,所得纯度分别为96%和98%,与田间纯度96.2%和97.8%非常接近。证明了用SSR标记技术检测杂交棉种子纯度是完全可行的,并验证了多重PCR组合应遵循的重要原则。4.未知种身份的识别:利用构建好的指纹图谱,通过遗传相似系数的计算和聚类分析比较,可以进行未知种身份的识别。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 构建杂交棉特征指纹及进行种子纯度分析的意义
• 1.1.1 种业市场的现状
• 1.1.2 构建杂交棉指纹图谱的必要性
• 1.1.3 种子纯度鉴定的作用
• 1.2 作物指纹图谱构建的方法及进展
• 1.3 种子纯度鉴定方法及进展
• 1.3.1 形态鉴定
• 1.3.1.1 种子形态鉴定法
• 1.3.1.2 幼苗形态检验法
• 1.3.1.3 田间种植鉴定
• 1.3.2 物理、化学特性鉴定法
• 1.3.2.1 物理特性鉴定
• 1.3.2.2 化学特性鉴定
• 1.3.3 生理生化鉴定法
• 1.3.3.1 同工酶电泳
• 1.3.3.2 种子贮藏蛋白电泳
• 1.3.4 DNA分子标记技术
• 1.3.4.1 DNA分子标记的概念
• 1.3.4.2 DNA分子标记的分类
• 1.3.5 杂交棉种子纯度的检测
• 1.4 本课题研究的目的和意义
• 第二章 实验仪器和试剂
• 2.1 主要仪器
• 2.2 主要试剂及配制
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要试剂的配制
• 第三章 研究材料和方法
• 3.1 实验地点
• 3.2 实验材料
• 3.3 研究方法
• 3.3.1 棉花基因组DNA的提取
• 3.3.1.1 棉花幼苗的培养
• 3.3.1.2 DNA提取方法
• 3.3.2 DNA质量检测和浓度检测
• 3.3.3 SSR引物序列信息搜集
• 3.3.4 PCR反应程序
• 3.3.5 SSR-PCR反应体系的优化设计
• 3.3.5.1 体系稳定性的检测
• 3.3.5.2 退火温度的筛选
• 3.3.5.3 上样量对电泳检测结果影响的比较
• 3.3.6 聚丙烯酰胺凝胶检测
• 3.3.7 湘杂棉指纹图谱的构建
• 3.3.8 湘杂棉种子纯度的检测
• 3.3.8.1 引物组合法在杂交种纯度检测中研究
• 3.3.8.2 未知种子的身份识别
• 第四章 实验结果与分析
• 4.1 DNA质量检测结果
• 4.2 SSR-PCR反应体系的建立
• 4.2.1 利用正交设计实验优化SSR-PCR反应体系
• 4.2.2 模板DNA用量对SSR-PCR扩增的影响
• 4.2.3 SSR-PCR反应体系稳定性检测
• 4.2.4 PCR反应程序中的退火温度
• 4.2.5 PCR反应产物上样量
• 4.2.6 SSR-PCR反应体系的确立
• 4.3 湘杂棉的指纹图谱
• 4.3.1 湘杂棉多态性引物的筛选
• 4.3.2 多态性引物对湘杂棉亲本自交系的扩增
• 4.3.3 特异分子标记
• 4.3.4 湘杂棉指纹图谱的构建
• 4.4 湘杂棉种子纯度的检测
• 4.4.1 适合种子纯度检测的共显性引物
• 4.4.2 多重PCR的扩增
• 4.4.2.1 SSR引物的分组
• 4.4.2.2 多重PCR扩增结果
• 4.4.3 三份湘杂棉种子纯度的鉴定
• 4.4.4 利用湘杂棉指纹图谱对未知种身份的识别
• 第五章 分析与讨论
• 5.1 棉花DNA提取
• 5.2 棉花SSR-PCR反应体系的优化
• 5.3 杂交棉指纹图谱的构建
• 5.4 SSR分子标记鉴定体系在种子纯度及真实性鉴定中的应用
• 5.4.1 识别未知品种
• 5.4.2 种子纯度的鉴定
• 第六章 全文总结
• 参考文献
• 缩略语表
• 附录
• 致谢
• 作者简历