小鼠ES细胞分化胆碱能神经及淫羊藿素促分化机制研究

论文摘要

本课题旨在探索小鼠胚胎干细胞定向分化胆碱能神经元过程中,记忆运动相关蛋白Junctophilin 3和Junctophilin 4表达及其特征。并探究淫羊藿素调控细胞微环境对小鼠ES细胞定向分化为胆碱能神经的影响,及分化过程中线粒体相关信号通路可能的涉及环节。RA诱导小鼠ES细胞定向分化过程中,外胚层标志基因表达上升,细胞经历了从神经前体细胞到成熟神经细胞的过程。分化的神经细胞表达mAChR和ChAT,JP-3,4在前体细胞期表达达峰值,在分化晚期反而下降。胚胎发育期大鼠胚脑样本JP-3,4基因、蛋白表达呈发育依赖性,但在成年大鼠大脑内表达量下降。而海马组织与ES细胞共培养未呈现促进小鼠ES细胞的神经分化。ICT具有促进小鼠ES细胞定向分化为胆碱能神经细胞作用,ERK抑制剂能发挥显著拮抗作用。JC-1染色结果显示ICT还具有促进线粒体形成,维持正常Δψm作用,DAPI染色显示ICT的促神经定向分化过程,未引起RA样细胞凋亡。RA诱导小鼠ES细胞定向分化胆碱能神经细胞同时,呈现各类mAChR基因表达;该过程尚伴有与记忆运动相关的JP-3,4阶段性表达。ICT促进小鼠ES细胞定向分化胆碱能神经,与其早期促进线粒体形成并维持正常Δψm作用有关。ICT促ES细胞定向分化并不经由ER依赖通路,而与ERK/p38MAPK信号通路有密切关系,诱导机制有待进一步深入研究。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 中英文/缩写对照表
• 目次
• 1 引言
• 2 实验仪器与材料
• 2.1 仪器
• 2.2 药物与主要试剂
• 2.3 实验动物及细胞株
• 3 实验方法
• 3.1 小鼠胚胎干细胞常规培养
• 3.1.1 原代小鼠胚胎成纤维细胞制备
• 3.1.2 饲养层细胞制备
• 3.1.3 ES细胞支持培养
• 3.2 小鼠ES细胞体外定向分化为神经细胞培养
• 3.2.1 悬滴培养
• 3.2.2 悬浮培养
• 3.2.3 贴壁分化培养
• 3.2.4 药物诱导ES细胞分化为神经细胞
• 3.3 动物交配及样本收集
• 3.4 小鼠海马组织与ES细胞共培养
• 3.5 逆转录-聚合酶链反应法检测基因表达
• 3.5.1 样本制备
• 3.5.2 细胞总RNA的提取
• 3.5.3 RNA浓度测定
• 3.5.4 逆转录
• 3.5.5 聚合酶链反应
• 3.5.6 琼脂糖凝胶电泳
• 3.6 免疫细胞化学法检测神经细胞亚型和发育相关蛋
• 3.7 流式细胞术定量检测特定阳性细胞
• 3.8 Western-blot检测蛋白表达
• 3.9 JC-1染色线粒体膜电位检测
• 3.10 DAPI染色细胞凋亡检测
• 3.11 数据分析
• 4 第一部分:小鼠ES细胞定向分化胆碱能神经及Junctophilin 3,Junctophilin4蛋白表达评价
• 4.1 实验结果
• 4.1.1 小鼠ES细胞定向分化神经细胞表型特征
• 4.1.2 小鼠ES细胞分化过程发育依赖性、神经特异性基因/蛋白表达
• 4.1.3 小鼠ES细胞分化细胞亚型评价
• 4.1.4 小鼠ES细胞分化胆碱能功能形成
• 4.1.5 小鼠ES细胞定向分化为神经细胞表达JP-3,JP-4蛋白
• 4.1.6 附:大鼠胚脑发育过程中JP3,JP4蛋白表达变化
• 4.1.7 小鼠海马组织和ES细胞共培养
• 4.2 讨论
• 4.3 小结
• 5 第二部分:淫羊藿素诱导小鼠ES细胞分化神经细胞的线粒体相关机制研究
• 5.1 实验结果
• 5.1.1 ICT诱导小鼠ES细胞定向分化胆碱能功能神经
• 5.1.2 雌激素受体抑制剂对胆碱能神经分化影响
• 5.1.3 ERK抑制剂对胆碱能神经分化影响
• 5.1.4 ICT诱导ES细胞定向分化神经细胞线粒体发生膜电位维持
• 5.1.5 小鼠ES细胞分化过程中凋亡终端事件评价
• 5.2 讨论
• 5.3 小结
• 6 总结
• 参考文献
• 作者简历