BLG/hLF基因转染山羊乳腺上皮细胞及TSA对转染基因表达的影响

论文摘要

转基因动物乳腺生物反应器是当前生物工程研究的热点。当人们将外源基因转染入哺乳动物细胞以后,总是希望外源基因能高效表达,并通过转基因动物克隆技术制作转基因动物,使其要求导入的外源基因在动物个体高水平表达所需要的新性状。然而事与愿违的是,许多转基因实验都导致了外源基因在哺乳动物细胞水平或动物个体水平不表达。研究表明在许多情况下外源基因整合进基因组后,其表达和转基因沉默有关。世界各国对转基因沉默机理及其防制展开了广泛研究,克服转基因沉默来提高外源基因的表达己经成为基因工程的一个重要课题。因此,有效预防转基因沉默,对提高外源基因的表达,提高制作转基因动物的成功率具有重要的理论和实际意义。本研究构建了BLG/hLF乳腺特异性表达载体BLC-14,建立了体外培养奶山羊乳腺上皮细胞（GMEC）系,并将构建的乳腺特异性表达载体BLC-14转染奶山羊乳腺上皮细胞,获得了阳性单克隆细胞株并用TSA处理,通过细胞水平的整合和表达检测,探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能否克服转基因沉默,解除转染入山羊乳腺上皮细胞基因组中的BLG/hLF基因表达受抑制的现象,从而提高BLG/hLF基因在乳腺上皮细胞中的表达水平,为研制乳腺特异性高效表达载体提供依据,为后期转基因体细胞核移植制备高表达转基因克隆动物乳腺生物反应器提供具有表达潜能的体（供核）细胞。1乳腺特异性表达载体的构建本实验利用实验室已有的人乳铁蛋白cDNA、奶山羊β-乳球蛋白（β-BLG）5`端（4.2Kb）、3`端（1.8Kb）表达调控序列、Neor、增强子序列构建出了BLG/hLF乳腺特异性表达载体BLC-14。2奶山羊乳腺上皮细胞系的建立用胶原酶消化法从经过催乳的刚成年奶山羊或者处于泌乳中后期的青年奶山羊乳腺实质组织中分离得到乳腺上皮细胞。采用分步消化法进行纯化,经过一到二次选择性传代培养,获得纯化的乳腺上皮细胞。用DMEM/F12+10%FCS培养液体外培养20代仍保持正常细胞繁殖扩增能力,生长良好。3 BLG /hLF基因转染奶山羊乳腺上皮细胞及TSA的处理BLG/hLF乳腺特异性表达载体BLC-14通过电转染法导入纯化的P1或者P2奶山羊乳腺上皮细胞中,共转染5个细胞系。经400μg﹒mL-1G418筛选培养液筛选三周后,得到有抗性的细胞株。挑取单克隆细胞株并进行扩大培养,共获得89株。随机取7株细胞DNA进行PCR检测,结果均为阳性。将单克隆细胞株分成实验组与对照组,实验组加入5μM催乳素、1μMTSA的诱导培养液,对照组只加入5μM催乳素的诱导培养液。诱导培养24小时后,利用间接ELISA检测,实验组与对照组均获得11株细胞能稳定表达人乳铁蛋白。实验组的平均表达水平是0.781μg﹒mL-1（106个细胞）,未用TSA处理的对照组表达水平是0.558μg﹒mL-1（106个细胞）。经统计学分析,TSA处理后的实验组要明显高于对照组。实验结果表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能提高BLG/hLF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达水平。所得到的高表达BLG/hLF的单克隆细胞将用作细胞核移植的供核细胞进行转基因克隆羊的制作。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 第一节 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展
• 1.1 国外转基因动物乳腺生物反应器的研究进展
• 1.2 国内转基因动物乳腺生物反应器的研究进展
• 1.3 转基因动物乳腺生物反应器的优点
• 第二节 体细胞介导的转基因动物乳腺生物反应器研究进展
• 2.1 体细胞介导的核移植技术制备转基因动物成为可能
• 2.2 体细胞转基因的优势
• 2.3 体细胞核移植制备动物乳腺生物反应器目前存在的问题
• 第三节 转基因沉默的研究进展
• 3.1 转基因沉默的机制
• 3.1.1 组蛋白的乙酰化与去乙酰化与转基因沉默
• 3.1.2 DNA 甲基化与转基因沉默
• 3.1.3 组蛋白甲基化与转基因沉默
• 3.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACis）及其作用机制
• 第二章 转染用人乳铁蛋白CDNA 乳腺特异性表达载体的准备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 分子生物学试剂
• 1.1.3 基因来源
• 1.2 方法
• 1.2.1 主要试剂的配制
• 1.2.2 常规分子生物学操作方法
• 1.2.3 BLC-14 载体质粒的构建
• 1.2.4 乳腺特异性载体的制备
• 1.2.5 转染基因的酶切、回收
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 奶山羊乳腺上皮细胞的培养
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要器械与仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 试剂的配置
• 1.2 方法
• 1.2.1 鼠尾胶原的制备及使用
• 1.2.2 奶山羊乳腺上皮细胞的获得与培养
• 1.2.2.1 奶山羊的催乳
• 1.2.2.2 奶山羊乳腺组织的手术取得
• 1.2.2.3 胶原酶消化法分离乳腺上皮细胞
• 1.2.2.4 细胞活力的测定
• 1.2.2.5 细胞计数
• 1.2.2.6 乳腺上皮细胞的纯化
• 1.2.2.7 细胞生长状况的观察
• 1.2.2.7.1 细胞贴壁率的测定
• 1.2.2.7.2 细胞生长曲线的测定
• 1.2.2.8 细胞冻存与解冻
• 1.2.2.8.1 细胞冻存
• 1.2.2.8.2 细胞的解冻
• 1.2.2.8.3 细胞存活测试
• 2 结果
• 2.1 奶山羊乳腺上皮细胞的原代培养
• 2.2 奶山羊乳腺上皮细胞的纯化与传代
• 2.3 细胞的贴壁率
• 2.4 细胞生长曲线
• 2.5 细胞的冻存与复苏
• 3 讨论
• 第四章 人乳铁蛋白基因电转染山羊乳腺上皮细胞克隆的获得及TSA 的处理
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 试剂及试剂的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 乳腺特异性载体的准备
• 1.2.2 转染基因的酶切、回收
• 1.2.3 电转染山羊乳腺上皮细胞
• 1.2.4 药物筛选
• 1.2.5 细胞株的获得与扩大培养
• 1.2.6 细胞株的PCR 检测
• 1.2.6.1 细胞株染色体 DNA 的提取
• 1.2.6.2 PCR 检测
• 1.2.7 TSA 处理及ELISA 检测
• 2 结果
• 2.1 G418 筛选浓度的确定
• 2.2 电转染用电压、脉冲时间的确定
• 2.3 细胞电转染
• 2.4 转染细胞DNA 的PCR 检测
• 2.5 整合BLC-14 基因细胞的诱导表达及TSA 的处理
• 3. 讨论
• 3.1 细胞的电转染
• 3.2 G418 的筛选
• 3.3 单细胞株的获得
• 3.4 体细胞来源和培养代数
• 3.5 TSA 的处理
• 参考文献
• 结论
• 致谢