论文摘要
近年来,以减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体靶向运送DNA疫苗至抗原提呈细胞,在小鼠和鸡模型中开展了大量的研究表明,能够激发机体产生细胞免疫应答、体液免疫应答和局部黏膜免疫应答。本试验在实验室原有的重组菌X4550（asd-pVAX1-HA）基础上,构建了以减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207为运送载体的重组菌SL7207（pVAX1-HA）、SL7207（pVAX1-NP）、SL7207（pVAX1-HA1）和SL7207（pVAX1-HA2）,通过不同的组合就其安全性和免疫效力进行评价。 首先根据GenBank中已发表的A型流感NP全基因序列设计并合成了一对PCR引物,通过RT-PCR扩增了鹅源H5亚型AIV毒株A/Goose/Jiangsu/1/2000（H5N1）NP基因。以重组质粒asd-pVAX1-HA为模板,设计并合成了两对引物,通过PCR方法扩增出HA1和HA2分段基因。将上述三种PCR产物克隆入pGEM-T easy vector进行测序。序列分析结果表明,所克隆到的NP基因与部分已发表的A型流感病毒NP序列的同源性在85%-97.9%,具有型特异性;HA1和HA2基因与模板序列同源性为100%。用EcoRV和XhoI双酶切NP基因,插入pVAX1相应酶切位点,构建成pVAX1-NP;用HindⅢ和BamHI双酶切HA1和HA2基因,分别插入pVAX1的相应酶切位点构建成pVAX1-HA1和pVAX1-HA2。转染COS-7细胞后通过间接免疫荧光试验证实NP、HA1和HA2基因在该细胞中得到了表达,说明三种质粒可以用于DNA疫苗试验。最后通过电转化方法将三种质粒以及pVAX1-HA导入鼠伤寒沙门氏菌SL7207,分别命名为 SL7207（pVAX1-HA）、SL7207（pVAX1-NP）、SL7207（pVAX1-HA1）和SL7207（pVAX1-HA2）,为进一步进行体内安全性和免疫效力试验奠定了基础。 携带质粒的重组菌在体外培养或入侵体内后,由于抗性选择压力的逐渐降低或消失,其携带质粒的比例也会随之降低,因此有必要对其体内外携带质粒的稳定性进行评价。结果表明,重组菌在体外培养9h后,携带质粒的比例开始明显下降（<90%）;SPF雏鸡口服接种1010CFU重组菌后,肝、脾等处分离的携带质粒重
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