拟除虫菊酯多残留酶联免疫检测方法的研究

论文摘要

本论文对拟除虫菊酯的免疫分析方法进行了深入系统的研究,利用已合成出的拟除虫菊酯通半抗原制备免疫原免疫BALB/C小鼠,通过单抗制备常规方法,得到一株对拟除虫菊酯类农药具有广谱特异性的杂交瘤细胞株,命名为2G2E7。该杂交瘤细胞株分泌的抗体类型为IgG1;通过制备腹水得到具有广谱特异性的拟除虫菊酯类农药公共单克隆抗体。通过优化方法工作条件,确定直接竞争酶联免疫检测方法中抗体包被浓度为0.5μig/well,酶标记抗原稀释度为1：9×105,缓冲液浓度为4.5%NaCl的PBS。建立了一种简便、快捷、实用的检测拟除虫菊酯类农药的直接竞争酶联免疫检测方法（dcELISA）。此法灵敏度较高,对溴氰菊酯IC50为1.8μg/L, IC15为0.24μg/L。对7种拟除虫菊酯进行交叉反应检测,结果显示,抗体对7种拟除虫菊酯均有较高的交叉反应,将溴氰菊酯交叉反应率定为100%,氯氰菊酯,氟氰胺菊酯,氰戊菊酯,苯醚菊酯,氟氰戊菊酯,甲氰菊酯的交叉反应率分别为：120%、90%、90%、82%、75%、60%,适用于拟除虫菊酯类杀虫剂多残留的快速检测。本实验选取了海河水作为主要检测样品,河水在过滤后,用PBS缓冲液稀释10倍后即可消除基质影响,添加回收实验,平均回收率在74-108%之间,验证了本方法的准确性。利用气相色谱检测方法,对建立的拟除虫菊酯直接竞争酶联免疫检测方法的准确性进行了验证。两种方法检测结果具有较高的相关性,进一步证明了拟除虫菊酯酶联免疫检测方法的准确性。结果显示,该单克隆抗体具有广谱特异性,能同时检测7种拟除虫菊酯类农药,并且为进一步研发拟除虫菊酯检测试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 拟除虫菊酯类农药
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 发展历史
• 1.1.3 特性
• 1.1.4 毒理性质
• 1.2 拟除虫菊酯类农药性质简介
• 1.2.1 溴氰菊酯
• 1.2.2 氯氰菊酯
• 1.2.3 氟胺氰菊酯
• 1.2.4 氰戊菊酯
• 1.2.5 苯醚菊酯
• 1.2.6 氟氰戊菊酯
• 1.2.7 甲氰菊酯
• 1.3 拟除虫菊酯的代谢途径
• 1.4 拟除虫菊酯的检测方法
• 1.4.1 分光光度法
• 1.4.2 色谱法
• 1.4.3 免疫分析方法
• 1.5 酶联免疫分析方法简介
• 1.5.1 酶联免疫分析方法原理
• 1.5.2 酶联免疫分析方法的主要类型
• 1.5.3 酶联免疫方法的建立
• 1.6 本研究的目的及内容
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.1.3 试验动物和细胞
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 半抗原的合成
• 2.2.2 人工免疫原（PBA-KLH）的制备
• 2.2.3 包被抗原（PBA-OVA）的制备
• 2.2.4 酶标抗原（PBA-HRP）的制备
• 2.2.5 单克隆抗体的制备
• 2.2.6 抗体浓度的测定
• 2.2.7 直接竞争酶联免疫检测方法的建立
• 2.2.8 样品基质对ELISA方法的影响分析
• 2.2.9 仪器分析法确证
• 2.2.10 直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3 结果与讨论
• 3.1 抗体的制备
• 3.1.1 抗血清效价的测定
• 3.1.2 细胞融合及筛选
• 3.1.3 单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定
• 3.2 抗体的纯化
• 3.2.1 腹水中蛋白质含量的变化
• 3.2.2 腹水蛋白的纯度变化
• 3.2.3 腹水纯化前后酶标稀释倍数的变化
• 3.3 直接竞争酶联免疫检测方法的建立
• 3.3.1 抗体包被量和酶标抗原稀释比例的优化
• 3.3.2 稀释液离子强度的确定
• 3.3.3 稀释液pH值的确定
• 3.3.4 直接竞争ELISA检测方法的建立
• 3.3.5 抗体的特异性
• 3.4 样品基质对ELISA分析的影响
• 3.4.1 水样品中基质影响的消除
• 3.4.2 水中的拟除虫菊酯样品检出限
• 3.4.3 添加回收试验
• 3.5 GC/ECD检测拟除虫菊酯残留
• 3.5.1 GC/ECD检测拟除虫菊酯标准曲线的建立
• 3.5.2 直接竞争ELISA检测结果与仪器分析结果的比较
• 3.6 直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.6.1 检出限与灵敏度
• 3.6.2 精密度
• 3.6.3 直接竞争ELISA稳定性实验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢