利用酵母双杂交系统研究水稻条纹病毒与寄主水稻之间的互作

论文摘要

近年来,由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起的水稻条纹叶枯病在各地爆发流行,已经成为我国水稻（Oryza sativa）生产上的重要的病害之一,给农业生产造成了严重的危害。国内外学者对RSV的生物学和分子生物学进行了广泛系统的研究,明确了水稻条纹叶枯病的地理分布、症状、病原性质、血清学、致病性分化、分子变异、细胞病理学及品种抗性等,但是对于该病毒一些蛋白的功能、病毒的致病机制及寄主对病毒的抗感病作用机制等尚不清楚。因此,从分子水平上研究病毒蛋白及其与寄主蛋白之间的互作关系,对于阐明上述诸多问题具有重要的意义。RT-PCR扩增获得了RSV三个功能蛋白的基因CP、SP和NSvc4,分别将其构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7和捕获载体pGADT7上,获得了重组子pGBK-CP、pGBK-SP、pGBK-NSvc4、pGAD-CP、pGAD-SP和pGAD-NSvc4。将上述重组子分别单独转化到酵母菌AH109中,在不同营养缺陷型培养基上检测CP、SP和NSvc4蛋白对酵母细胞的毒性和自激活活性。将重组子两两共转化到酵母菌AH109中,于不同营养缺陷型培养基上检测RSV CP、SP、NSvc4三个蛋白自身之间及两两之间的互作情况。结果表明,RSV CP、SP、NSvc4三个蛋白对酵母菌AH109都未表现出毒性和自激活活性,酵母双杂交结果显示RSV CP蛋白自身能够发生互作,而SP、NSvc4蛋白自身未有检测到互作现象的存在,CP与SP,CP与NSvc4,SP与NSvc4蛋白之间也未有检测到互作现象。提取对RSV抗性差异显著而遗传背景基本一致的两个水稻品种（品系）“武育粳3号”和“KT95-418”幼苗叶片总RNA,通过SMART技术合成了双链cDNA,通过合适的酶切位点将cDNA片段定向插入到改造的载体NpGADT7中,构建了两品种（品系）水稻的酵母双杂交cDNA文库。文库质量鉴定结果表明:所构建的两个文库库容量均大于1.0×106cfu,初始文库滴度分别为1.0×1010cfu/mL和5.0×1010cfu/mL,扩增文库滴度为1.0×1011cfu/mL。两文库重组率均大于95%,“武育粳3号”文库cDNA插入片段长度集中分布在700-800 bp之间,“KT95-418”集中分布在750-1,000 bp之间。小规模测序结果表明两文库中全长基因的比例均超过60%。抽提纯化两种文库质粒,分别将其转化到含有诱饵质粒pGBK-CP、pGBK-SP和pGBK-NSvc4的酵母菌AH109中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,筛选可能与诱饵蛋白互作的阳性克隆。PCR鉴定阳性克隆子中cDNA插入片段的大小,将含有不同长度插入片段的酵母质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中,并送交公司测序。在GenBank数据库中对测序结果进行Blast比对,寻找同源序列。根据同源序列的注释信息,分析所筛选的阳性克隆菌落中cDNA插入片段的大小、序列完整性、读码框正确性等。结果表明,以不同的诱饵筛选不同的cDNA文库获得了不同种类和数量的阳性克隆:以RSV CP为诱饵,从“武育粳3号”文库中筛选获得4个不同的阳性克隆;以RSV CP为诱饵,从“KT95-418”文库中筛选获得2个不同的阳性克隆;以RSV SP为诱饵,从“武育粳3号”文库中筛选获得5个不同的阳性克隆;以RSV SP为诱饵,从“KT95-418”文库中筛选获得6个不同的阳性克隆;以RSV NSvc4为诱饵,从“武育粳3号”文库中筛选获得9个不同的阳性克隆;以RSV NSvc4为诱饵,从“KT95-418”文库中筛选获得9个不同的阳性克隆。根据数据库中阳性克隆对应同源基因的功能注释,并结合已有文献对该互作蛋白的研究报道,初步推测了蛋白互作在RSV致病和寄主对病毒侵染应答过程中可能发挥的作用。从酵母双杂交筛选结果中挑取了3个比较有意思的克隆CW8、NB2和NB5,RT-PCR扩增其基因全长并进行测序鉴定。结果表明,扩增获得了NB2和NB5全长基因,而CW8扩增产物较之数据库同源序列要短。将全长NB2和NB5构建到酵母双杂交捕获载体pGADT7上获得了重组子pGAD-NB2和pGAD-NB5。将pGAD-NB2和pGAD-NB5分别与诱饵质粒pGBK-CP、pGBK-SP、pGBK-NSvc4共转化酵母菌AH109,并涂布不同的营养缺陷型培养基平板,检测NB2和NB5全长基因表达产物与RSV CP、SP和NSvc4的互作情况。结果表明,NB2、NB5完整蛋白均能与NSvc4发生互作,而与CP、SP不具有互作关系。为了进一步验证上述利用酵母双杂交系统检测蛋白互作的实验结果,又分别以重组子pGBK-CP、pGBK-SP和pGBK-NSvc4为模板,PCR扩增获得了融合有c-Myc标签的CP、SP和NSvc4基因;以pGAD-CP、pGAD-SP、pGAD-NSvc4和pGAD-NB5为模板,PCR扩增获得了融合有HA标签的CP、SP、NSvc4和NB5基因。分别将上述融合基因构建在植物表达载体pEGAD和pKYLX71:35S2载体。重组质粒转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105后,制备农杆菌注射液并注射本氏烟（Nicotiana benthamiana）,使外源蛋白在本氏烟叶片中瞬时表达。提取本氏烟叶片总蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,收集免疫混合物,SDS-PAGE电泳后,以c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。检测结果与酵母双杂交结果一致:RSVCP蛋白自身能够发生互作,而CP与SP,CP与NSvc4,SP与SP,SP与NSvc4,及NSvc4与NSvc4蛋白之间均未有检测到互作现象;NSvc4能够与NB5发生互作,而未检测到CP、SP与NB5之间存在互作关系。利用荧光定量PCR（Real Time PCR）技术检测CW8、NB5和SB12基因mRNA在健康水稻叶片和RSV侵染后的水稻叶片中的表达情况。比较mRNA表达量的差异,从而分析RSV侵染及病毒蛋白与寄主蛋白互作对其mRNA表达情况的影响。结果表明,CW8 mRNA在RSV侵染后的水稻中与在健康水稻中的表达量相比表现为下调;NB5 mRNA表达量基本不存在差异:SB12mRNA在RSV侵染后的水稻中与在健康水稻中的表达量相比表现为上调。除上述研究之外,本论文还研究了水稻条纹病毒CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达情况:PCR扩增获得水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和RSV CP基因。分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体,通过两种方法构建了融合基因PR-CP和PR-S-CP。将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）并诱导表达。SDS-PAGE电泳检测其表达产物与预期结果大小一致。Western-blot鉴定发现两种融合基因的表达产物均能与RSV CP抗体特异结合,说明融合蛋白中RSV CP蛋白保持了自身的抗原活性,叶绿体Rubisco SSU引导肽并未影响其正确表达。可以推测两种融合基因PR-CP和PR-S-CP在生物体内表达时,融合蛋白中的Rubisco SSU引导肽和RSV CP蛋白有可能都能保持各自独立的结构和功能。综上所述,通过酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术研究了RSV三个功能蛋白CP、SP和NSvc4自身和两两之间的互作情况:利用酵母双杂交系统从两个水稻品种（品系）cDNA文库中筛选了可能与CP、SP和NSvc4具有互作关系的寄主蛋白,并通过免疫共沉淀技术对其中几个寄主蛋白与诱饵蛋白的互作情况进行了进一步验证;利用荧光定量PCR技术对可能与病毒蛋白互作的几种寄主蛋白mRNA在RSV侵染后的水稻中的表达变化情况进行了检测:另外,构建了RSV CP与叶绿体Rubisco引导肽的融合基因,通过SDS-PAGE和Western-blot检测了其在大肠杆菌中的表达情况。本研究将为我们进一步明确RSV蛋白的功能,了解RSV的致病机制、寄主对RSV的抗感病作用机理及开发抗病种质资源提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 水稻条纹病毒（RSV）的研究概况
• 1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生及危害
• 1.1.2 水稻条纹叶枯病的病害症状
• 1.1.3 水稻条纹叶枯病的品种抗性
• 1.1.4 水稻条纹叶枯病的流行原因分析
• 1.1.5 水稻条纹叶枯病的预测预报及防治对策
• 1.1.6 RSV的寄主范围和传播介体
• 1.1.7 RSV的病原性质
• 1.1.8 RSV的血清学
• 1.1.9 RSV的分类地位
• 1.1.10 RSV的基因组结构与功能
• 1.1.10.1 RNA1区段
• 1.1.10.2 RNA2区段
• 1.1.10.3 RNA3区段
• 1.1.10.4 RNA4区段
• 1.1.11 RSV的致病性分化和分子变异
• 1.1.11.1 RSV的致病性分化
• 1.1.11.2 RSV的分子变异
• 1.1.11.3 分子变异与致病性分化之间的关系
• 1.1.12 RSV与寄主及介体的互作情况
• 1.1.12.1 RSV与寄主水稻间的互作
• 1.1.12.2 RSV与介体灰飞虱间的互作
• 1.2 酵母双杂交系统及其在植物病毒研究中的应用
• 1.2.1 酵母双杂交系统
• 1.2.1.1 酵母双杂交系统的原理和操作流程
• 1.2.1.2 酵母双杂交系统的优点及局限性
• 1.2.1.3 酵母双杂交系统的发展
• 1.2.2 酵母双杂交系统在植物病毒学上的应用
• 1.2.2.1 酵母双杂交系统在病毒粒体分子结构和装配研究中的应用
• 1.2.2.2 酵母双杂交系统在病毒核酸复制及基因表达调控研究中的应用
• 1.2.2.3 酵母双杂交系统在病毒编码蛋白联系图谱研究中的应用
• 1.2.2.4 酵母双杂交系统在病毒运动模式研究中的应用
• 1.2.2.5 酵母双杂交系统在病毒致病机制研究中的应用
• 1.2.2.6 酵母双杂交系统在病毒介体传播的分子机制研究中的应用
• 1.3 免疫共沉淀技术用于验证蛋白互作
• 1.4 荧光定量 PCR用于检测基因表达情况
• 1.5 本研究的目的和意义及主要技术路线
• 2 RSV CP、SP和NSvc4酵母表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试毒源
• 2.1.1.2 菌株和质粒
• 2.1.1.3 PCR引物
• 2.1.1.4 主要试剂
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 水稻病叶总RNA的提取
• 2.1.2.2 RT-PCR扩增RSV CP、SP、NSvc4
• 2.1.2.3 PCR产物的检测和回收
• 2.1.2.4 目的片段与pMD18-T克隆载体连接
• 2.1.2.5 连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 2.1.2.6 阳性克隆的鉴定筛选
• 2.1.2.7 酵母表达载体的构建
• 2.1.2.8 阳性克隆的测序鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 RSV CP、SP、NSvc4基因的PCR扩增
• 2.2.2 重组克隆载体的鉴定
• 2.2.3 重组酵母表达载体的鉴定
• 2.2.4 阳性克隆的测序鉴定
• 2.3 小结与讨论
• 3 水稻幼苗叶片cDNA文库的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 实验材料
• 3.1.1.2 菌株和质粒
• 3.1.1.3 PCR引物
• 3.1.1.4 主要试剂
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 水稻幼苗叶片总RNA的提取
• 3.1.2.2 mRNA的分离纯化
• 3.1.2.3 cDNA的合成
• 3.1.2.4 双链cDNA的酶切处理
• 3.1.2.5 pGADT7载体的改造
• 3.1.2.6 NpGADT7载体的酶切处理
• 3.1.2.7 NpGADT7载体连接和自连效率的检测
• 3.1.2.8 cDNA与载体NpGADT7的连接转化
• 3.1.2.9 初始文库的收集和滴度测定
• 3.1.2.10 文库扩增和滴度测定
• 3.1.2.11 文库质粒的抽提和鉴定
• 3.1.2.12 cDNA插入片段的检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 样品总 RNA的提取及检测
• 3.2.2 mRNA的分离纯化及检测
• 3.2.3 cDNA的合成及酶切处理
• 3.2.4 NpGADT7载体的酶切处理和检测
• 3.2.5 NpGADT7载体的自连率检测
• 3.2.6 cDNA与载体NpGADT7的预连接
• 3.2.7 文库库容量和滴度的测定
• 3.2.8 文库质粒的抽提及检测
• 3.2.9 cDNA插入片段大小的检测
• 3.2.10 cDNA插入片段序列测定
• 3.3 小结与讨论
• 4 利用酵母双杂交系统研究RSV三个功能蛋白自身和两两之间的互作
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌株和质粒
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 载体和菌株的验证
• 4.1.2.2 载体和菌株的保存
• 4.1.2.3 AH109感受态细胞的制备
• 4.1.2.4 重组质粒转化酵母菌 AH109
• 4.1.2.5 重组质粒的自激活活性检测
• 4.1.2.6 重组质粒对AH109细胞毒性检测
• 4.1.2.7 两重组质粒共转化AH109
• 4.1.2.8 蛋白互作的检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 载体与菌株的验证
• 4.2.2 重组质粒对细胞毒性和自激活活性检测
• 4.2.3 蛋白自身互作的检测
• 4.2.4 蛋白两两互作的检测
• 4.3 小结与讨论
• 5 利用酵母双杂交系统筛选水稻cDNA文库
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 菌株和质粒
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.1.3 PCR引物
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 酵母细胞转化方法的选择
• 5.1.2.2 含有诱饵质粒的酵母菌AH109感受态细胞的制备
• 5.1.2.3 文库质粒大规模转化含有诱饵质粒的AH109感受态细胞
• 5.1.2.4 阳性克隆菌落的筛选
• 5.1.2.5 阳性克隆酵母质粒的提取
• 5.1.2.6 PCR鉴定阳性克隆中文库质粒的cDNA插入片段
• 5.1.2.7 酵母质粒转化大肠杆菌DH5α及PCR再鉴定
• 5.1.2.8 阳性克隆的测序及分析
• 5.1.2.9 阳性克隆与基因芯片和双向电泳结果的比较分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 阳性克隆的筛选
• 5.2.2 PCR鉴定cDNA插入片段
• 5.2.3 阳性克隆的测序及分析
• 5.2.4 阳性克隆与基因芯片和双向电泳结果的比对分析
• 5.3 小结与讨论
• 6 互作蛋白全长基因的扩增及蛋白互作的酵母双杂交验证
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 实验材料
• 6.1.1.2 菌株和质粒
• 6.1.1.3 主要试剂
• 6.1.1.4 PCR引物
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 水稻病叶总RNA的提取
• 6.1.2.2 RT-PCR扩增目的基因
• 6.1.2.3 目的基因的克隆
• 6.1.2.4 酵母表达载体的构建
• 6.1.2.5 两质粒共转化酵母细胞
• 6.1.2.6 蛋白互作的检测
• 6.1.2.7 重组质粒的测序鉴定及互作蛋白的序列比对分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 CW8、NB2、NB5基因的PCR扩增
• 6.2.2 CW8、NB2、NB5基因的克隆
• 6.2.3 目的基因酵母表达载体的构建
• 6.2.4 两蛋白互作的检测
• 6.2.5 重组质粒的测序鉴定及互作蛋白的序列比对分析
• 6.3 小结与讨论
• 7 利用免疫共沉淀技术验证两蛋白之间的互作
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.1.1 菌株和质粒
• 7.1.1.2 PCR引物
• 7.1.1.3 主要试剂
• 7.1.2 方法
• 7.1.2.1 目的基因的扩增
• 7.1.2.2 扩增产物的检测和回收
• 7.1.2.3 目的基因的克隆和鉴定
• 7.1.2.4 植物瞬时表达载体的构建
• 7.1.2.5 重组质粒转化农杆菌EHA105
• 7.1.2.6 含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定
• 7.1.2.7 含有重组质粒的农杆菌注射本氏烟及瞬时表达
• 7.1.2.8 外源蛋白在本氏烟中表达情况的检测
• 7.1.2.9 本氏烟叶片总蛋白的提取及免疫共沉淀反应
• 7.1.2.10 SDS-PAGE电泳及Western blot检测
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 目的基因的扩增
• 7.2.2 目的基因的克隆
• 7.2.3 植物瞬时表达载体的构建
• 7.2.4 含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定
• 7.2.5 外源蛋白在本氏烟中的表达情况检测
• 7.2.6 蛋白互作情况的检测
• 7.3 小结与讨论
• 8 利用荧光定量PCR技术检测几个互作蛋白mRNA的表达情况
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.1.1 供试材料
• 8.1.1.2 主要试剂
• 8.1.2 方法
• 8.1.2.1 荧光定量PCR引物的设计
• 8.1.2.2 RNA的抽提和质量检测
• 8.1.2.3 cDNA的合成
• 8.1.2.4 最佳退火温度的确定
• 8.1.2.5 目的基因和内参基因标准曲线的建立
• 8.1.2.6 荧光定量PCR检测不同样品中目的基因的表达量
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 样品总RNA的质量检测
• 8.2.2 最佳退火温度的确定
• 8.2.3 目的基因和内参基因的融解曲线
• 8.2.4 目的基因和内参基因的扩增曲线
• 8.2.5 目的基因和内参基因的标准曲线
• 8.2.6 目的基因和内参基因的原始定量
• 8.2.7 目的基因的相对定量
• 8.3 小结与讨论
• 9 RSV CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.1.1 植株和毒源
• 9.1.1.2 菌株和质粒
• 9.1.1.3 PCR引物
• 9.1.1.4 主要试剂
• 9.1.2 试验方法
• 9.1.2.1 叶片总RNA的提取
• 9.1.2.2 PCR扩增Rubisco SSU和RSV CP基因
• 9.1.2.3 pMD-R和pMD-CP克隆载体的构建
• 9.1.2.4 PR和PR-S的扩增和克隆
• 9.1.2.5 pGEX-PR和pET-PR-S表达载体的构建
• 9.1.2.6 带不同酶切位点的CP基因的扩增和克隆
• 9.1.2.7 PR-CP和PR-S-CP融合基因的构建
• 9.1.2.8 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 9.1.2.9 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 9.1.2.10 表达产物的SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定
• 9.2 结果与分析
• 9.2.1 PCR扩增Rubisco SSU和RSV CP基因
• 9.2.2 pMD-R和pMD-CP克隆载体的构建
• 9.2.3 PR和PR-S的扩增和克隆
• 9.2.4 pGEX-PR和pGEX-PR-S表达载体的构建
• 9.2.5 带有不同酶切位点的CP基因的扩增和克隆
• 9.2.6 PR-CP和PR-S-CP融合基因的构建
• 9.2.7 重组质粒转化宿主菌BL21（DE3）的鉴定
• 9.2.8 融合基因在大肠杆菌中的表达
• 9.2.9 表达产物的Western blot鉴定
• 9.3 小结和讨论
• 10 全文总结与展望
• 10.1 RSV CP、SP和NSvc4互作情况的检测
• 10.2 与RSV CP、SP和NSvc4互作的寄主蛋白的筛选和验证
• 10.3 mRNA在健康水稻叶片和RSV侵染后的水稻叶片中表达差异分析
• 10.4 RSV CP与水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达
• 参考文献
• 附录1 缩略语及含义
• 附录2 所用载体图谱
• 附录3 攻博期间发表及投稿的文章
• 致谢