论文摘要
目的:脓毒症（Sepsis）是由感染因素引起的全身失控性炎症反应综合症（Systemic inflammatory response syndrome, SIRS）,脓毒症休克和多器官功能障碍综合症（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）是死亡的重要原因,病死率高达50% - 80%,至今尚无有效的治疗手段。革兰阳性细菌可以通过其细菌本身及菌体成分,如肽聚糖、磷壁酸等,刺激机体导致感染性休克。由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）导致的脓毒症由于其对多种抗生素的耐药,因此表现出相较于甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）导致的脓毒症更差的预后,最终可导致脓毒症休克及死亡。在MRSA脓毒症治疗中我们不仅仅要控制MRSA细菌的繁殖,也要控制细菌感染所导致的炎症反应。然而在现有的临床治疗中,针对脓毒症的药物只有重组人活化C蛋白（recombinant human activated protein C,rhAPC）,但是现在它的疗效也被质疑。若能寻找到既可以克服MRSA耐药,又可以有效控制脓毒症的药物具有重大的意义。MRSA作为一种“超级细菌”,对大量的抗菌药物都表现为耐药,只对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等少数抗菌药物有效。MRSA对β-内酰胺类抗生素的最主要耐药机制:一是产生β-内酰胺酶,β-内酰胺酶利用其活性位点的丝氨酸水解β-内酰胺环,水解β-内酰胺类抗生素而致耐药;二是减少菌体内药物的含量,包括增加细菌外膜通透性或抑制细菌的主动外排系统;三是大量表达特殊的青霉素结合蛋白------PBP2a。其中以mecA基因及其表达的PBP2a蛋白为靶点着手寻找控制MRSA的方法是目前科学家们研究的焦点与热点。但迄今为止,以PBP2a为靶点研究的药物尚未获得成功。在金黄色葡萄球菌中,研究者们已经发现了超过10种以上的外排泵,如NorA, NorB, NorC、MdeA、MepA、QacA/B等。大部分的外排泵均属于主要易化子超家族,包括染色体编码的的外排泵NorA、NorB、NorC等,及质粒编码的外排泵QacA/B等。此外还有其他种类的外排泵也陆续被发现,如MepA属于多药和毒物排出家族,Smr属于小多重耐药家族。尽管这些外排泵的底物各不相同,但是他们中大多数的底物都属于不同的类别,因此都可以导致细菌表现为多重耐药。大量前炎症因子的释放是脓毒症的特征之一,TNF-α为早期前炎症细胞因子之一,而IL-6是晚期前炎症因子之一。革兰阳性细菌的菌体成分如肽聚糖,磷壁酸可以通过TLR2（Toll-like receptor 2）和NOD2 （nucleotide-binding oligomerization domain containing 2）途径介导的信号通路,诱导这些前炎症细胞因子的释放。细菌的大量繁殖可以导致持续的前炎症细胞因子的释放,最终导致失控性脓毒症甚至脓毒症性休克。MRSA是临床超级耐药菌治疗棘手,而青蒿琥酯不仅能够增强现有抗菌药物的抗MRSA活性,而且还具有抗炎活性。因此在本项目中我们希望通过青蒿琥酯对MRSA脓毒症治疗作用及作用机制的深入研究,为青蒿琥酯的老药新用、以及对其结构改造得到更高抗菌增敏作用及抗炎作用的衍生物奠定实验基础。基于上述实验结果与分析,本课题将MRSA脓毒症作为研究对象,在体内外研究青蒿琥酯增强β-内酰胺类抗生素对MRSA脓毒症小鼠的保护作用及其可能机制。方法:1.青蒿琥酯联合β-内酰胺类抗生素对MRSA脓毒症模型小鼠的保护作用1.1建立致死剂量WHO-2脓毒症小鼠模型,观察青蒿琥酯联合β-内酰胺类抗生素对模型小鼠的死亡率的影响;1.2.建立亚致死剂量WHO-2脓毒症小鼠模型,观察青蒿琥酯联合β-内酰胺类抗生素对模型小鼠血中细菌数量及前炎症细胞因子释放的影响。2.青蒿琥酯增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA的作用及分子机制研究2.1.微孔稀释法观察青蒿琥酯和β-内酰胺类抗生素对WHO-2和临床分离株的MIC、青蒿琥酯和β-内酰胺类抗生素联合使用对WHO-2和临床分离株MICs生长的影响;动态生长曲线法观察青蒿琥酯和β-内酰胺类抗生素联合使用对WHO-2的体外协同抗菌作用;2.2.动态生长曲线法观察青蒿琥酯抗菌增敏作用与β-内酰胺酶的关系;2.3.生物传感器技术观察青蒿琥酯与PBP2a的亲和力;Realtime PCR技术观察青蒿琥酯对β-内酰胺酶类抗生素诱导后WHO-2菌mecA基因表达的影响;2.4.激光共聚焦、荧光分光光度法观察青蒿琥酯对柔红霉素在WHO-2内聚集的影响;液质联用技术观察青蒿琥酯对苯唑西林在WHO-2内聚集的影响;透射电镜技术观察青蒿琥酯对WHO-2菌胞壁通透性的影响;Realtime PCR技术观察青蒿琥酯对β-内酰胺酶类抗生素刺激后WHO-2菌外排泵基因表达的影响。3.青蒿琥酯抗炎作用及分子机制研究3.1. ELISA法检测青蒿琥酯对热灭活WHO-2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的影响;3.2. Realtime-PCR法及Western-blot法观察青蒿琥酯对热灭活WHO-2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TLR2、NOD2 mRNA及蛋白表达的影响;ELISA法检测青蒿琥酯对热灭活WHO-2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活化的影响。结果:1.青蒿琥酯联合β-内酰胺类抗生对MRSA脓毒症模型小鼠的保护作用1.1.青蒿琥酯能明显增强β-内酰胺类抗生素对WHO-2脓毒症模型小鼠的保护作用;1.2.青蒿琥酯联合β-内酰胺类抗生素能明显降低WHO-2脓毒症模型小鼠血中细菌水平及血浆TNF-α和IL-6水平,效果强于单独使用β-内酰胺类抗生素。2.青蒿琥酯增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA的作用及分子机制研究2.1.青蒿琥酯能明显降低WHO-2和MRSA临床分离株对β-内酰胺类抗生素的耐药性;2.2.青蒿琥酯抗菌增敏作用与β-内酰胺酶无关;2.3.青蒿琥酯与PBP2a具有直接结合作用,并且亲和力高于其他的抗菌药物;青蒿琥酯对β-内酰胺酶类抗生素诱导后WHO-2菌mecA基因的高表达具有抑制作用;2.4.青蒿琥酯可增加柔红霉素和苯唑西林在WHO-2内聚集;抗菌增敏浓度下青蒿琥酯不破坏WHO-2细胞壁结构;青蒿琥酯对β-内酰胺酶类抗生素诱导后WHO-2菌部分外排泵基因表达升高具有抑制作用。3.青蒿琥酯的抗炎作用及分子机制研究3.1.青蒿琥酯对热灭活WHO-2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6具有抑制作用;3.2.青蒿琥酯对热灭活WHO-2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TLR2、NOD2 mRNA及蛋白表达及NF-κB活化具有抑制作用。结论:1.青蒿琥酯能明显增强β-内酰胺类抗生素对MRSA脓毒症模型小鼠的保护作用;该作用与其增强抗生素降低MRSA脓毒症模型小鼠血中细菌水平和炎性细胞因子水平相关;2.青蒿琥酯对β-内酰胺类抗生素抗MRSA具有增敏作用,该作用与其抑制mecA基因的表达,或直接结合PBP2a有一定关系;也可能与其增加MRSA细菌内药物的聚集有关,该增加药物聚集的作用可能是通过抑制部分外排泵引起;3.青蒿琥酯的抗炎作用机制可能与其抑制TLR2、NOD2的表达,抑制NF-κB活性,从而减少致炎细胞因子TNF-α、IL-6的释放有关。
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