植酸酶产酶菌株的体外诱变及中性植酸酶基因在WB800中的高效表达

论文摘要

植酸是植物饲料中磷的主要储存形式。由于单胃动物（如家禽、猪等）体内缺乏分解植酸的酶,因此植酸难以得到有效的利用。植酸酶（肌醇六磷酸）是一种能水解植酸的新型的可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂。在饲料中添加植酸酶则可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿物质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染。虽然植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中,但是其天然产量低,缺乏热稳定性,不适用于商业应用。因此,为了克服天然植酸酶的缺点,人们利用各种手段对酶分子进行改造,以期能提高植酸酶的热稳定性,pH值范围和生物学活性。本文通过体外诱变将自行筛选的产胞外植酸酶的黑曲霉菌株作为出发株,通过Co60及原生质体紫外光照射的联合诱变法,提高了野生菌株的产酶活力。此外,应用基因工程菌技术,将中性植酸酶phyL和168phyA基因连接构建到分泌表达载体PMA5中,并转化到WB800中实现表达,为商业化生产奠定了理论基础。本实验的主要结果如下:1.黑曲霉变异株A-828酸性植酸酶的生物合成和性质的研究:经钴60及原生质体紫外联合诱变后,筛选出一株高产植酸酶的菌株（A-828）,酶活力达到66000U/ml,为出发株的17倍。通过滤膜超滤浓缩和Bio-gel P-150层析纯化,纯化倍数为11.2倍,活力回收率为37.7%。SDS-PAGE分析表明,变异株植酸酶的分子量约为66KD,酶学实验结果表明:该酶的最适pH有两个,分别为2.5和5.5,但在2.5时所表现的活力是5.5时的5倍,酶的最适温度为55℃。在20℃～60℃保温20min,活力不改变。2mmol/L的Fe2+、Cu2+Cr3+抑制了酶的活性,但同样浓度Ca2+、Mn2+、EDTA、DTT对酶的活力影响不显著。2.芽孢杆菌中性植酸酶的高效表达和酶学性质:将地衣芽孢杆菌源的phyL和枯草芽孢杆菌源的168phyA基因连接到PMA5载体中,并转化到WB800中表达,活力分别达到350000U/ml和30000U/ml。SDS-PAGE分析表明,phyL和168phyA植酸酶的分子量约为45KD,酶学实验结果表明:这两个酶的最适pH广泛,在7时所表现的活力是100%,酶的最适温度为65℃和55℃。在60℃到90℃保温20min,活力不改变。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 文献综述
• 1 植酸的研究
• 1.1 植酸的特性
• 1.2 植酸的分布
• 1.3 植酸（盐）对动物和环境的影响
• 2 植酸酶的研究和应用
• 2.1 植酸酶的定义及作用原理
• 2.2 植酸酶的酶学特性
• 2.3 植酸酶的基因
• 2.4 植酸酶的活力单位及测定方法
• 第二章 选题背景与目的意义
• 1 选题的背景
• 1.1 植酸酶应用前景
• 1.2.当前改造酶分子的常用方法
• 1.3.目前植酸酶的基因工程的研究
• 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.4.1 芽孢杆菌简介
• 1.4.2 芽孢杆菌表达系统
• 1.4.3 芽孢杆菌也有它的缺点
• 1.4.4 芽孢杆菌常用的宿主和载体，包括近年来新兴的Brev-bacillus brevis
• 1.4.5.外源蛋白的分泌表达
• 2.目的与意义
• 2.1 本项研究的对象
• 2.2 本项研究的目的
• 第三章 试验研究
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 中性植酸酶基因
• 1.3 培养基
• 1.4 酶与试剂
• 1.5 引物
• 1.6.实验所用溶液及其配制
• 1.7 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 黑曲霉源植酸酶的体外联合诱变的操作方法
• 2.2 枯草杆菌基因工程菌构建方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 黑曲霉源植酸酶的体外联合诱变
• 3.1.1 技术路线
• 3.1.2.结果与分析
• 3.1.3.讨论
• 3.2.中性植酸酶基因在枯草芽孢杆菌WB800中的表达
• 3.2.1 技术路线
• 3.2.2.结果与分析
• 3.2.3 讨论
• 第四章 结论与创新
• REFERENCE
• 发表的文章
• 致谢
• 缩略词