微管剪切蛋白Katanin的体内功能解析

论文摘要

微管剪切蛋白Katanin是ATPase家族的一员,由Katanin60和Katanin80两个亚基组成。其中Katanin80亚基没有酶切功能但可使Katanin定位于中心体。Katanin60亚基具有ATP酶活,行使微管剪切功能。目前对katanin体内功能的研究只限于模式动物线虫,尚没有在其他模式动物如果蝇和小鼠中研究,因此,体外实验的结果还没有得到体内试验的验证。其次,虽然体外的研究阐明了katanin突变可以导致其细胞中微管网络的破坏,但是由于这些研究是基于体外培养细胞的研究,因此不能完全解释Katanin在个体生长发育特别是神经肌肉系统发育过程中的作用。我们从VDRC(维也纳果蝇中心)购得katanin60RNAi果蝇工具株；并利用p因子定点跳出的方法获得了katanin60的突变体果蝇；通过扩增katanin60CDS连入pUAST载体,显微注射到果蝇胚胎后进行筛选和定位,得到katanin60过表达果蝇工具株。并从国外合作者处得到抗体,随后利用免疫染色和生化分子等方法检测katanin60过表达和敲减果蝇以及突变体的蛋白表达量和表达位置。在鉴定和验证以上各种工具后,我们用微管特异性抗体对果蝇三龄幼虫肌肉细胞的微管结构进行了观察,同时还用神经系统也以表达的蛋白观察了果蝇神经突触结构的发育。我们在果蝇体内进行了研究。免疫染色结果显示,在肌肉细胞中,过表达katanin60可以提高微管剪切的程度,且优先剪切细胞核周围的微管,造成细胞核周围微管密度减小,而敲减果蝇katanin60的表达可以造成细胞核周围微管密度增加。katanin60突变体果蝇的肌肉细胞微管成簇且延伸至细胞边缘。在冷冻处理恢复微管的实验中我们看到,Katanin功能的行使需要一定的微管密度。Katanin不仅影响果蝇肌肉微管的发育,同时影响神经系统的发育。在katanin60过表达和突变体果蝇中,神经肌肉接头卫星扣结数目较野生型明显增多。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 模式生物果蝇
• 1.1.1 果蝇作为模式生物的优势
• 1.1.2 GAL4/UAS组织特异性表达系统
• 1.2 微管的功能及参与调节微管组装的分子
• 1.2.1 微管的分子结构
• 1.2.2 微管的功能
• 1.2.3 调节微管组装的分子
• 1.3 微管剪切蛋白Katanin结构和功能
• 第二章 材料与方法
• 2.1 本研究所用果蝇品系和抗体
• 2.2 果蝇遗传学操作
• 2.2.1 果蝇培养基的制备
• 2.2.2 果蝇的雌雄鉴别
• 2.2.3 处女蝇的收集
• 2.2.4 果蝇DNA的提取
• 2.2.5 果蝇三龄幼虫解剖
• 2.3 免疫荧光染色、图片采集和分析
• 2.3.1 免疫染色
• 2.3.2 图片采集与数据处理
• 2.4 SDS-PAGE和免疫印迹分析
• 2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.2 Western-blot免疫印迹分析
• 2.5 果蝇工具株的构建
• 2.5.1 突变体果蝇的构建
• 2.5.2 过表达果蝇的构建
• 第三章 结果与结论
• 3.1 突变体和过表达果蝇的Katanin60蛋白表达量
• 3.2 Katanin60抗体染色
• 3.2.1 Katanin60抗体在果蝇肌肉细胞中的染色
• 3.2.2 Katanin60抗体在果蝇神经系统中的染色
• 3.3 katanin60突变体和过表达果蝇在肌肉细胞中的表型
• 3.4 katanin60突变体和过表达果蝇在神经系统中的表型
• 3.5 冷处理恢复实验
• 3.6 结论
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢