水稻蛋白激酶底物的筛选和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的生化与表达分析

论文摘要

植物体在生长发育中不断接受外界环境及体内细胞间的各种刺激,引发一系列信号转导途径,并做出相应的生理生化反应。在这些信号转导途径中,受体激酶或类受体激酶担当着一个极为重要的角色。鉴于蛋白激酶的重要性和特殊性,蛋白激酶底物的筛选一直是人们关注的研究热点。本文从抗稻瘟病类受体激酶Pi-d2的酵母双杂交筛选的结合蛋白出发,开展的工作主要是体外磷酸化验证及初步的功能分析;同时研究了这些元件与抗白叶枯病受体激酶XA21的相互关系;另外,进一步开展了激酶底物Pib3（OC-I,编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂）及其同源蛋白质OC-II的生化及表达分析。论文主要结果总结如下:1.利用酵母双杂交技术,宋文源实验室筛选获得了12个Pi-d2的结合蛋白质,本实验通过磷酸化分析,发现Pib1的C端、Pib3、Pib4和Pib8等不但能被Pi-d2磷酸化,也能被XA21磷酸化,为不同抗病基因介导的抗病途径的重叠提供初步的证据。2. Pib1编码蛋白质是泛素系统中决定底物特异性识别的E3连接酶,包括一个U-box结构域,5个Arm结构域。U-box结构域对于促进底物蛋白泛素化降解,在细胞内异常蛋白质的降解及质量控制方面发挥着重要的作用。本文研究表明Arm结构域与激酶可以发生相互作用。这可能预示着Pib1有可能通过激酶的磷酸化启动细胞死亡与抗性功能。3. Pib3编码水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂,生化实验证明,Pib3可以有效地抑制半胱氨酸蛋白酶,抑制率为50%。植物有时会通过蛋白酶抑制剂阻止病原菌蛋白酶对寄主组织的降解,使其营养不足,生长受阻,从而达到抗病的目的。4. Pib4编码丝氨酸家族蛋白酶抑制剂,也和Pib3一样,有可能参与植物的发育调节和抗病防御反应。5.Pib8是MAPKKK家族成员,本文发现的磷酸化证据支持其可能参与植物（类）受体激酶调控的抗病途径。6.水稻中有12个半胱氨酸蛋白酶抑制剂（OC-I至OC-XII）,本文同时初步开展了OC-II的生化特性分析,结果表明,OC-II能与抗白叶枯病菌受体激酶XA21体外相互结合。进一步开展RNAi、超表达将有助于阐明其生物学功能。本文鉴定了多个受体激酶的底物,并发现了它们与受体激酶的体外结合,为其功能研究奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 水稻蛋白激酶的底物筛选研究
• 1 引言
• 1.1 水稻中的（类）受体激酶
• 1.2 水稻抗白叶枯病基因相关研究进展
• 1.2.1 抗白叶枯病基因Xa21 的研究进展
• 1.2.2 抗白叶枯病基因Xa26 的研究进展
• 1.2.3 抗白叶枯病基因xa5 的研究进展
• 1.3 水稻抗稻瘟病基因相关研究进展
• 1.3.1 抗稻瘟病基因Pi-d2 的研究进展
• 1.3.2 抗稻瘟病基因Pi-d3 的研究进展
• 1.3.3 抗稻瘟病基因pi-21 的研究进展
• 1.4 蛋白激酶的底物及筛选策略
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料、试剂和仪器
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Pi-d2 侯选底物的基因扩增及蛋白表达
• 2.2.2 Pi-d2 蛋白的诱导表达
• 2.2.3 蛋白质的自我磷酸化及底物磷酸化活性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 Pi-d2 结合蛋白的PCR 扩增
• 3.2 Pi-d2 结合蛋白的体外诱导表达
• 3.3 Pib4 蛋白质的诱导表达
• 3.4 Pi-d2 对结合蛋白的磷酸化分析
• 3.4.1 Pi-d2 对Pib1 的磷酸化分析
• 3.4.2 Pi-d2 对Pib3 的磷酸化分析
• 3.4.3 Pi-d2 对Pib4 的磷酸化分析
• 3.4.4 Pi-d2 对Pib8 的磷酸化分析
• 3.5 XA21 对Pi-d2 结合蛋白质的磷酸化分析
• 4 结论
• 第二章 水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂的生化与表达分析
• 1 引言
• 1.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族在免疫调节中的作用
• 1.2 本研究的意义和目的
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抑制酶活测定
• 2.2.2 转录谱（EST 和MPSS）分析
• 2.2.3 蛋白质的体外结合试验
• 3 结果与分析
• 3.1 重组蛋白OC-I 和OC-II 的体外表达
• 3.2 OC-I 和OC-II 蛋白质的酶活分析
• 3.3 OC-I 和OC-II 编码基因的转录分析
• 3.4 OC-II 蛋白质与XA21 的体外结合分析
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢