论文摘要
锯缘青蟹属肉食性、广盐、广温性海水经济甲壳动物,是我国东南沿海地区重要的海洋经济养殖蟹类。近年来,每年9月到11月份,汕头市牛田洋养殖区的青蟹都会因病害而发生大规模死亡,严重困扰青蟹养殖业的发展,给地方经济造成了巨大损失。迄今为止,牛田洋青蟹大规模死亡的病因尚未探明。本研究主要以病蟹的临床症状和组织病理学变化、细菌性病原菌的分离和鉴定及蟹类寄生虫鉴定等方面为切入点,较系统地研究了牛田洋青蟹的病害种类及主要病原。主要研究结果如下:（一）病蟹临床病症病蟹活动力弱,附肢易掉落,少数附肢溃烂,甲壳出现黑色溃疡并伴有黄色斑点,关节膜黄色或水肿;解剖病蟹,体内多无色液体,部分病蟹血淋巴不凝固,血淋巴乳白色或黄色,肝胰腺变白、萎缩甚至糜烂,鳃黑色或褐色;附肢肌肉液化或白浊。（二）牛田洋青蟹病害主要类型牛田洋青蟹由细菌性病原引起的病害主要有“黄斑病”、黑鳃病、“黄水病”和甲壳溃疡病;寄生虫引起的病害有板茗荷和血卵涡鞭虫病。（三）青蟹细菌性病害研究从牛田洋患病青蟹体内分离得到4种细菌（HY、HG、S901和S902）,HY和HG在TCBS培养基上生长的颜色分别为黄色和绿色,S901和S902在Zobell 2216E培养基上生长的颜色分别为橙色和浅黄色。菌株HY和HG均属于革兰氏阴性杆菌,S901和S902分别为革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌。人工感染实验证实4种细菌都是青蟹的病原菌。感染病原菌的青蟹的肝胰腺、鳃和心脏组织都出现不同程度的组织病变。菌株HY和HG的生理生化特性分别与嗜水气单胞菌和副溶血弧菌相似。以4种菌株DNA为模板扩增的16S rRNA基因序列长度分别为1509、1532、1527和1490 bp;经16S rRNA基因序列同源性比对及系统发育学分析,发现HY与嗜水气单胞菌聚为一支,且亲缘关系最近,其相似性为99.35%,HG与副溶血弧菌聚为一支,且亲缘关系最近,其相似性为98.46%,S901和S902分别与微小杆菌属和节杆菌属细菌自然聚类。以上结果说明,HY和HG分别被鉴定为嗜水气单胞菌和副溶血弧菌,S901为微小杆菌属细菌,S902为节杆菌属细菌。4种病原菌均对氧氟沙星、庆大霉素、链霉素、阿莫西林敏感,副溶血弧菌和S902对磺胺嘧啶敏感,S901和S902对青霉素钠敏感。4种病原菌对甲砜霉素中度敏感,嗜水气单胞菌对磺胺嘧啶中度敏感。S901对磺胺嘧啶不敏感,嗜水气单胞菌和副溶血弧菌对青霉素钠不敏感。让青蟹通过浸泡或肌肉注射感染嗜水气单胞菌致病后,用阿莫西林粉剂配成15μg/ml水体连续药浴3天,对病蟹有较好的疗效。（四）青蟹血卵涡鞭虫病研究牛田洋养殖青蟹有的患有一种被称为“牛奶病”的疾病。病蟹消瘦,肌肉白浊,血淋巴为牛奶样白色,且不凝固,可引起大量死亡。病蟹症状同血卵涡鞭虫Hematodinium引起的兰蟹和蛛雪蟹“牛奶病”症状相似。对患“牛奶病”青蟹的血淋巴涂片进行显微镜检,发现血淋巴中布满大量处于不同时期的寄生性原虫,如原生质体状、营养体和似变形虫营养体,多为卵圆型。对血淋巴涂片进行HE染色后镜检,可见腰鞭孢子期原虫和大量黑色原生质体,多为单核或多核。肝胰腺、心脏、肌肉和后肠的病变组织中布满大量黑色原生质体状寄生原虫。以患“牛奶病”青蟹的肝胰腺、肌肉和血淋巴提取的DNA为模板,利用血卵涡鞭虫特异性引物进行PCR,都可以扩增到一条约200 bp的目的条带;以健康青蟹肝胰腺DNA为模板进行的PCR未得到目的条带。综合临床症状观察、血淋巴涂片检测、组织病理学和分子生物学鉴定结果,确定血卵涡鞭虫Hematodinium是青蟹“牛奶病”的主要病原。此外,我们还从患“牛奶病”青蟹的血淋巴、肝胰腺中分离到2株优势菌株（嗜水气单胞菌和副溶血弧菌）,说明为综合感染。以上结果说明:细菌和寄生虫是引起牛田洋养殖青蟹患病的主要病原生物。嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、微小杆菌属和节杆菌属细菌是青蟹主要的细菌性病原,能引起肝胰腺、鳃和心脏等组织产生明显的病理变化;致病菌的药敏试验及病害药物治疗试验结果可为养殖生产中青蟹病害的药物防治提供依据。本研究是首次报道嗜水气单胞菌为青蟹的病原菌。血卵涡鞭虫是导致青蟹“牛奶病”的主要病原,该病同时并发感染嗜水气单胞菌和副溶血弧菌。另外,牛田洋青蟹养殖池塘的盐度为4‰-8‰,据我们所知,这是低盐度养殖环境下的海产甲壳类感染寄生性血卵涡鞭虫的首次报道。