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竹类植物生长发育过程中的DNA甲基化研究

2020-12-12阅读(540)

竹类植物生长发育过程中的DNA甲基化研究

论文摘要

为探究竹类植物生长发育过程中的表观遗传现象,采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）和高效液相色谱（HPLC）技术对不同生理年龄的毛竹（Phyllostachys heterocycla var. pubescens）、开花与未开花的孝顺竹（Bambusa. multiplex）、以及同一生理起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹（Ph.vivax f.aureocaulis）的幼嫩叶片进行了基因组DNA甲基化检测,得到如下结论:1、毛竹基因组DNA甲基化水平随生理年龄的增加呈上升趋势。选择5年、31年及﹥60年生的毛竹林分,采用35对引物组进行MSAP分析发现:在毛竹营养生长过程中,随生理年龄的增加,基因组同时发生DNA的甲基化和去甲基化现象,其中发生甲基化的变异位点（52.3%）远大于去甲基化变异位点（10.3%）,从而使基因组DNA甲基化率随年龄的增加呈现上升趋势,方差分析显示:同一林分的毛竹单株（包括同一出笋年龄和不同出笋年龄的毛竹单株）基因组DNA甲基化水平没有显著差异,但不同生理年龄的毛竹林分间差异达到了极显著水平（P<0.001）。2、筛选6对引物组合,建立了MSAP技术下的毛竹基因组DNA甲基化与生理年龄的回归模型。对实验采用的35对引物组合进行统计分析,筛选了随毛竹生理年龄增加DNA甲基化水平增加,而且每相邻两个年龄间差异达到极显著水平的6对引物组合（E+CA/HM+CAC、E+CA/HM+CTC、E+CA/HM+CTG、E+AG/HM+CTA、E+AG/HM+CTC、E+AA/HM+CTA）。将筛选的6对引物进行主成分分析,通过累积贡献率大于90%以及特征根大于1这两个条件,确定各对引物在判识毛竹生理年龄中的权重,得到一个综合指标,即:Y=0.173x1+0.172x2+0.172x3+0.178x4+0.176x5+0.180x6,用以代表毛竹随生理年龄变化的基因组DNA总甲基化水平。随后选择2年、6年、13年、18年、32年和﹥60年生等6个年龄段毛竹林分,采用上述的6对引物进行MSAP检测。对统计数据进行模型拟合,得到毛竹生理年龄与其基因组DNA甲基化率的二次回归模型:Z =0.542y2+0.003y+17.999,R2=0.970。这对野外毛竹林分的生理年龄判定具有重要的实践意义。3、孝顺竹由营养生长转生殖生长时基因组DNA甲基化水平明显降低采用HPLC技术对孝顺竹开花前后的基因组DNA甲基化进行了研究,结果发现:孝顺竹在未开花的生长发育过程中,DNA甲基化率呈现不规则的波动现象。方差分析显示:无论是同一竹丛不同时期,还是相同时期不同竹丛DNA甲基化率均无显著差异（P =0.109﹥0.05和P =0.622﹥0.05）。对孝顺竹同一丛内（同一无性系）开花与未开花单株的MSAP检测,结果发现:开花竹株的DNA甲基化变异条带占了总条带数的33.17%,其中发生甲基化的位点（22.28%）远大于去甲基化位点（1.98%）,导致开花植株DNA的甲基化率显著低于未开花植株,差异达到了极显著水平（P<0.001）。对开花与未开花竹株的同一样品分别采用HPLC和MSAP技术检测DNA甲基化,结果发现:HPLC检测的总甲基化率（开花26.69%;未开花30.61%）显著高于MSAP检测结果（开花9.00%;未开花12.42%）,但趋势一致。这主要与HPLC技术能够测定基因组整体DNA甲基化水平,而MSAP技术只能对全基因组的胞嘧啶甲基化水平进行分析的特点有关。4、同一生理起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹有随地理纬度的降低,DNA甲基化水平逐渐降低的现象。黄秆乌哺鸡是乌哺鸡竹的变种,于1982年在浙江省安吉竹博园被发现,因观赏价值高,现已扩繁引种到全国的许多地区。对采自北京良乡、江苏南京、浙江安吉、江西南昌、四川长宁、广东南雄,共6个地区的黄秆乌哺鸡竹基因组DNA进行了研究。首先,采用AFLP技术对6个地区的样品进行的遗传多样性分析表明:同一无性起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹叶片基因组DNA序列无明显差异;但经MSAP检测发现:不同地区DNA总甲基化率和全甲基化率分别为:北京良乡（33.62%和19.57%）、江苏南京33.19%和19.27%)、浙江安吉（31.19%1和8.60%）、江西南昌（30.93%和18.01%）、四川长宁（29.50%和16.32%）、广东南雄（28.78%和14.49%）,有随地理纬度的降低DNA甲基化水平呈现降低的趋势。另外,将筛选的与毛竹生理年龄相关的6对引物组合应用于黄秆乌哺鸡竹的MSAP检测发现:不同地区黄秆乌哺鸡竹MSAP扩增条带一致,无显著差异,即同一无性起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹基因组DNA未发生明显甲基化变异。这也从另一角度验证了,筛选的6对引物组合在竹类植物生理年龄判识中的可行性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 引言
  • 1.1.1 研究背景
  • 1.1.2 国内外研究现状
  • 1.2 本研究目的意义及研究内容
  • 1.2.1 研究的目的意义
  • 1.2.2 主要研究内容
  • 1.2.3 研究技术路线
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.2 主要仪器和试剂
  • 2.2.1 主要仪器
  • 2.2.2 试剂配置
  • 2.3 实验方法
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 方法体系的建立
  • 3.1.1 MSAP 和AFLP 体系的建立
  • 3.1.2 HPLC 体系建立
  • 3.1.5 小结与讨论
  • 3.2 毛竹生理年龄与基因组 DNA 甲基化水平的相关性
  • 3.2.1 不同生理年龄间毛竹基因组 DNA 甲基化分析
  • 3.2.2 同一林分不同出笋年龄间毛竹基因组 DNA 甲基化分析
  • 3.2.3 不同生理年龄间毛竹基因组 DNA 甲基化带型分析
  • 3.2.4 小结与讨论
  • 3.3 基于特定引物组合进行毛竹生理年龄与DNA 甲基化相关性模型建立
  • 3.3.1 MSAP 检测过程中扩增引物组合的分析
  • 3.3.2 基于物定引物组合的 MSAP 检测结果进行综合因子确定
  • 3.3.3 毛竹生理年龄与基因组 DNA 甲基化水平间的初步模型建立
  • 3.3.4 小结与讨论
  • 3.4 孝顺竹开花过程中基因组 DNA 甲基化变化规律
  • 3.4.1 孝顺竹开花过程中基因组 DNA 总甲基化水平的 HPLC 分析
  • 3.4.2 基于 MSAP 的孝顺竹开花与未开花单株的 DNA 甲基化水平分析
  • 3.4.3 孝顺竹开花与未开花状态下 DNA 甲基化带型分析
  • 3.4.4 毛竹年龄相关的特定引物组与孝顺开花
  • 3.4.5 小结与讨论
  • 3.5 不同生境的黄秆乌哺鸡竹的 AFLP 和 MSAP 分析
  • 3.5.1 不同生境下黄秆乌哺鸡竹的遗传多样性分析
  • 3.5.2 不同地区黄秆乌哺鸡竹基因组 DNA 总甲基化水平分析
  • 3.5.3 不同地理环境条件下毛竹年龄相关的特定引物组合的扩增情况
  • 3.5.4 小结与讨论
  • 第四章 结论与讨论
  • 4.1 结论
  • 4.2 讨论
  • 4.2.1 MSAP 与HPLC 技术比较
  • 4.2.2 DNA 甲基化与竹类植物年龄的关系
  • 4.2.3 DNA 甲基化与竹类植物的开花
  • 4.2.4 DNA 甲基化受环境影响的变异
  • 4.2.5 特异片段分析
  • 4.3 展望
  • 参考文献
  • 在读期间的学术研究
  • 致谢

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