论文摘要
目的:胃癌的发病是多种肿瘤基因,肿瘤抑制基因,DNA修复基因,细胞周期调控因子及细胞黏附分子的遗传学和表遗传学改变的结果。DNA甲基化作为一种表遗传事件在胃癌的发生发展过程中有重要的作用。研究肿瘤中DNA异常甲基化对于探索肿瘤的发病机制有重要意义,并且可能为肿瘤的检测提供新的分子检测方法。目前对DNA甲基化进行检测的方法有很多,包括亚硫酸盐测序法,甲基化特异性PCR(MSP),Methylight和COBRA等。多数方法集中于定性检测阶段,关于DNA甲基化定量检测的报道较少。因此许多研究者致力于探索DNA甲基化的定量检测方法。本实验研究目的是建立一种能广泛应用于临床的快速、简便、灵敏度和特异性较好、价格低廉的DNA甲基化定量检测方法。应用本方法检测胃癌、癌前病变及正常组织中p16及hMLH1基因DNA甲基化的定量水平,为其临床应用建立实验基础。方法:1.收集天津医科大学总医院2007年5月至2007年7月经胃镜下活检的组织标本,胃癌组42例,癌前病变组(不典型增生与肠化生)46例,对照组(正常胃黏膜及慢性浅表性胃炎)38例。2.应用Lightcycler定量PCR仪,以SYBR Green I作为荧光定量检测标记,建立DNA甲基化定量检测方法。3.定量检测胃癌、癌前病变及正常胃组织黏膜中p16及hMLH1基因DNA甲基化水平。结果SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、重复性、特异性均较高,最小检测极限为1.012×10~2 copies/ul。6次荧光定量PCR反应标准品10~4～10~7 copies/ul浓度梯度的循环阈值(Ct)均值分别为17.03、20.26、23.21、26.63,各浓度梯度Ct值的批间变异系数(CV)分别是3.85%、3.35%、3.54%、2.35%。对亚硫酸盐处理后的甲基化及非甲基化基因溶解温度峰值Tm进行检测发现,溶解温度峰值在84.0℃～88.0℃左右,溶解温度单一,不含有模板的阴性对照及单纯双蒸水的空白对照组均未见特异性峰值出现,研究还发现甲基化的特异性产物的溶解曲线峰值较非甲基化的溶解曲线峰值较高。胃癌、癌前病变及正常组织病变中p16基因甲基化定量水平(对数值)分别是6.99±1.20、5.40±1.48、3.55±1.55,三组之间p16基因甲基化定量水平比较,差异有统计学意义(P＜0.05),任意两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。由正常组织、癌前病变到胃癌p16基因甲基化定量水平呈上升趋势。胃癌、癌前病变及正常组织病变中p16基因非甲基化定量水平(对数值)分别是3.78±1.77、6.58±1.42、7.31±1.08,三组之间p16基因非甲基化定量水平比较,差异有统计学意义(P＜0.05),任意两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。由正常组织、癌前病变到胃癌p16基因非甲基化定量水平呈下降趋势。不同性别、不同年龄阶段的胃癌中,p16基因甲基化定量水平差异没有统计学意义(P＞0.05);不同病理组织类型及不同病变部位的胃癌中p16基因甲基化定量水平差异没有统计学意义(P＞0.05);而不同恶性程度及是否伴有淋巴转移、血行转移的胃癌中,p16基因甲基化定量水平差异有统计学意义(P＞0.05)。胃癌、癌前病变及正常组织中hMLH1基因甲基化定量水平(对数值)分别是7.07±1.50、4.87±1.71、2.48±0.51,三组之间hMLH1基因甲基化定量水平差异有统计学意义(P＜0.05),任意两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。由正常组织、癌前病变到胃癌hMLH1基因甲基化定量水平呈上升趋势。胃癌、癌前病变及正常组织中hMLH1基因非甲基化定量水平(对数值)分别是5.74±1.98、6.47±1.17、7.38±1.26,三组之间hMLH1基因非甲基化定量水平比较,差异有统计学意义(P＜0.05),任意两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。由正常组织、癌前病变到胃癌hMLH1基因非甲基化定量水平呈下降趋势。不同性别、不同年龄阶段的胃癌中hMLH1基因甲基化定量水平差异没有统计学意义(P＞0.05),不同病理组织类型及是否伴有血行转移的胃癌中hMLH1基因甲基化定量水平差异没有统计学意义(P＞0.05),而不同恶性程度及是否伴有淋巴转移的的胃癌中,hMLH1基因甲基化定量水平差异有统计学意义(P＜0.05),不同病变部位的胃癌中hMLH1基因甲基化定量水平差异有统计学意义(P＜0.05),胃窦部位病变中hMLH1基因甲基化定量水平最高。结论:1.成功的建立了一种快速,高效,经济,敏感性,特异性,稳定性较好的DNA甲基化定量检测方法。2.由正常胃黏膜、癌前病变到胃癌组织中p16及hMLH1基因甲基化定量检测水平呈上升趋势。3.胃癌中p16基因甲基化定量水平与胃癌的恶性程度及淋巴转移、血行转移有关,胃癌中hMLH1基因甲基化定量水平与胃癌的恶性程度及淋巴转移有关。4.p16及hMLH1基因甲基化是胃癌发生中的早期事件,p16及hMLH1基因甲基化可以作为胃癌早期诊断的一个重要指标,定量检测p16及hMLH1基因甲基化水平对于胃癌的早期诊断、早期治疗及判断预后有重要的临床意义。