小鼠肝炎病毒（MHV）金标快速检测方法的建立

论文摘要

小鼠肝炎病毒（简称MHV）感染是一种严重危害小鼠生产的病毒性传染病,可引起小鼠致死性肝炎、脑炎和肠炎,对小鼠的饲养和发展造成巨大威胁。鼠群感染MHV多数情况下呈亚临床型感染,对实验研究产生严重的干扰作用。因此,研制特异、快速、简便的诊断试剂盒对鼠群进行MHV的监测,将是预防和控制MHV感染的有效措施。本试验利用抗MHV（毒株MHV-JHM及MHV-A59）抗体探针建立检测MHV的胶体金免疫层析方法。利用柠檬酸三钠还原法分别制备粒径约为20nm和15nm的胶体金；设计方阵实验测得并测得稳定0.5ml胶体金最低抗体量为5.05μg；选用M135作为本实验的层析材料;并选用3%BSA作为封闭液；实验确定检测线抗体蛋白最适包被量为640μg/ml左右,质控线抗体蛋白包被浓度为800μg/m1左右。我们用均一性好的20 nm的胶体金标记抗MHV（毒株MHV-JHM及MHV-A59）混合抗体,同时用此抗体和羊抗鼠IgG二抗包被M135硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,与金标垫组装成试纸条,此方法能在10min之内特异的检测出含有MHV抗原的样品,即检测线和质控线显示两条红线,对于不含MHV抗原的样品则只显示质控线一条红线。结论胶体金免疫层析方法能快速,特异及稳定的检测出MHV抗原。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 小鼠肝炎病毒概述
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 MHV的结构和致病机制
• 1.1.3 MHV感染免疫相关研究
• 1.1.4 目前MHV常用的检测方法
• 1.2 胶体金技术概述
• 1.2.1 免疫胶体金技术的基本原理及胶体金颗粒制备方法
• 1.2.2 两种常见的免疫胶体金快速检测方法
• 1.2.3 免疫胶体金技术的应用进展
• 1.2.4 前景与展望
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 阳性血清
• 2.1.4 免疫层析材料
• 2.1.5 主要试剂和溶液
• 2.1.6 主要溶液及其具体配制方法
• 2.1.7 主要仪器设备及耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒的培养及滴定
• 2.2.2 攻毒及抗体纯化
• 2.2.3 胶体金颗粒的制备和鉴定
• 2.2.4 胶体金标记抗体最适合PH值及最小标记蛋白量的确定
• 2.2.5 抗体的金标记及鉴定
• 2.2.6 硝酸纤维素膜的选择
• 2.3 封闭液的选择
• 2.3.1 金标垫上的金标抗体浓度的确定
• 2.3.2 检测线抗体蛋白包被浓度及质控线二抗包被浓度的确定
• 2.3.3 试纸条的组装
• 2.3.4 试纸条的检测方法和结果判定
• 2.3.5 稳定性试验
• 2.3.6 重复性实验
• 3 实验结果
• 3.1 病毒培养与鉴定
• 3.2 组织毒的滴定及抗体纯化
• 3.3 不同胶体金颗粒的制备和鉴定
• 3.4 胶体金标记抗体最适合PH值及最小标记蛋白量的确定
• 3.5 金标抗体的鉴定
• 3.6 硝酸纤维素膜的选择
• 3.7 封闭液的选择
• 3.8 金标垫上金标抗体浓度确定
• 3.9 检测线抗体蛋白包被浓度的确定及质控线抗体蛋白包被浓度的确定
• 3.10 试纸条的组装及结果判定
• 3.11 稳定性试验
• 3.12 重复性试验
• 4 结论
• 5 讨论
• 5.1 小鼠肝炎病毒感染流行特点及实验动物标准化
• 5.2 免疫方法的选择
• 5.3 胶体金免疫层析诊断方法的建立
• 5.4 胶体金性质
• 5.5 抗体的纯化
• 5.6 蛋白质与胶体金的吸附
• 5.7 胶体金免疫层析试纸条的敏感性
• 5.7.1 胶体金标记抗体的浓度
• 5.7.2 膜对蛋白的吸附量
• 5.7.3 免疫层析材料的选择
• 5.8 胶体金标记抗体的浓度
• 5.9 膜对蛋白的吸附量
• 5.10 免疫层析材料的选择
• 5.11 胶体金粒径的选择
• 5.12 点样环境
• 5.13 试纸条的组装及保存
• 5.14 试纸条的检测效果及存在问题
• 致谢
• 参考文献