破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位疫苗研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作为一种中枢退行性疾病,是老年痴呆的最主要形式。依据最新的统计结果,世界上大约有2700万人口受到该病的影响。目前,淀粉样蛋白级联假说（Amyloid Cascade Hypothesis）是一种主流的关于AD发病机制的推测。该假说认为患者脑内堆积过多的p淀粉样多肽是造成AD的最根本原因。1999年,Schenk等首先开展了以Aβ为靶点的AD主动免疫治疗研究,将人纤维化的Aβ1-42（简称Aβ42）多肽联合弗氏佐剂免疫APP转基因小鼠Tg2576后,小鼠体内产生了针对Aβ42的抗体,减少了大脑内的淀粉样斑块,改善了认知能力。随后,动物模型上的其他相关研究表明AD的主动免疫治疗策略是有效的,但之后的AN-1792临床试验结果表明Aβ42中存在的2个T细胞表位（17-21,29-42）诱导产生的T细胞免疫反应使得受试者出现了急性脑膜炎症状。目前关于AD主动免疫的研究更倾向于使用Aβ42的B细胞表位（1-15）并去除有害的T细胞表位,既让疫苗达到促进抗体生成的目的,又从根本上避免之前临床试验所产生的不良反应。因此,我们在此理论基础上进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位重组亚单位疫苗和核酸疫苗的研究工作。首先进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位重组亚单位疫苗的研究,设计了3种融合多个Aβ1-15（简称Aβ15）串联基因、PADRE基因和破伤风毒素重链C端（简称TTC）基因的重组蛋白原核表达载体,实现了重组融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达并成功地纯化得到了电泳级纯度的重组蛋白。然后将纯化获得的重组蛋白免疫普通Balb/C小鼠,测定的抗Aβ特异性抗体水平结果显示重组蛋白免疫动物后能够诱导小鼠产生高水平的Aβ特异性抗体,并且通过血清抗体的亚型分析和脾细胞增殖实验结果提示免疫反应完全偏向于Th2型。斑点杂交实验结果表明产生的抗Aβ抗体倾向于与Aβ寡聚体结合,与纤维状Aβ结合能力较弱。进一步将其中一种重组蛋白免疫APP转基因AD模型小鼠,实验结果显示重组蛋白在模型小鼠中仍然具有良好的免疫原性,免疫特性与普通Balb/C小鼠相似。行为学实验评价结果显示免疫后小鼠认知能力得到了一定改善。小鼠大脑组织免疫组化实验结果表明免疫组小鼠Aβ斑块明显减少。以上实验结果提示重组蛋白作为预防或治疗AD的候选亚单位疫苗具有良好的应用前景。在重组蛋白亚单位疫苗研究的基础上,进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位核酸疫苗的研究。设计了2种融合6个Aβ1-15串联基因、PADRE基因和破伤风毒素重链C端基因的DNA真核表达载体作为DNA疫苗。经IFA检测表明得到的2种真核表达载体均能使Aβ15和TTC基因在真核细胞中得到有效地表达。DNA疫苗免疫普通小鼠诱导生成了较高水平的抗Aβ抗体,并且免疫反应完全偏向于Th2型。斑点杂交实验结果仍然提示设计的DNA疫苗产生的抗体倾向与Aβ可溶性寡聚体结合。DNA疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后,也产生了良好的免疫反应,并且免疫组小鼠大脑组织内的Aβ斑块明显少于未免疫组小鼠,提示该DNA疫苗可能拥有较好的免疫预防效果,可作为AD疫苗的一种新发展方向。综上,本研究设计和制备了3种重组蛋白亚单位疫苗和2种重组核酸疫苗,实验结果表明各疫苗在普通Balb/C小鼠体内产生了高水平的针对Aβ42的特异性抗体,并且有效地避免了Th1型免疫反应,免疫反应完全偏向于Th2型。斑点杂交实验表明产生的抗体倾向于与Aβ寡聚体结合,提示抗体可能针对毒性较大的Aβ寡聚体拥有更好的清除或中和能力,这一免疫特性对疫苗的下一步深入研究具有重要意义。疫苗免疫AD转基因小鼠以后,产生了同普通Balb/C小鼠的相当的免疫效果,并且小鼠认知能力得到了改善,脑组织内的Aβ斑块明显少于未免疫组转基因小鼠。本研究首次证实了破伤风毒素片段作载体分子介导阿尔茨海默病B细胞表位疫苗能够提高其免疫原性反应的可行性。以上结果表明本研究设计和制备的这种新型重组Aβ15表位疫苗拥有良好的免疫效果,具备了新型AD疫苗的发展方向,具有良好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 阿尔茨海默病及其免疫治疗机制简述
• 1.2 阿尔茨海默病主动免疫治疗现状
• 1.3 本研究AD疫苗研究策略及主要研究内容
• 2 破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病重组Aβ1-15嵌合疫苗研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 引物的设计
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 抗体、蛋白、多肽
• 2.1.6 动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 原核表达载体的构建
• 2.2.2 重组蛋白的表达和纯化
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳
• 2.2.4 Western Blot免疫印迹试验
• 2.2.5 蛋白质的定量分析
• 2.2.6 动物免疫实验
• 2.2.7 血清抗体测定
• 2.2.8 细胞免疫水平检测
• 2.2.9 斑点杂交实验（Dot-blot）
• 2.2.10 APP转基因AD模型动物免疫实验
• 2.2.11 血清抗体测定（转基因小鼠部分）
• 2.2.12 小鼠行为学实验
• 2.2.13 免疫组化检测小鼠大脑组织Aβ斑块
• 2.2.14 统计学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 3种原核表达载体的构建
• 2.3.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达,纯化及鉴定
• 2.3.3 免疫小鼠血清特异性抗体水平
• 2.3.4 T细胞免疫应答反应
• 2.3.5 斑点杂交实验结果
• 2.3.6 ELISA法测定各免疫阶段抗Aβ的抗体水平（转基因小鼠部分）
• 2.3.7 免疫后小鼠血清抗体滴度以及抗体亚型分析（转基因小鼠部分）
• 2.3.8 免疫后小鼠行为学实验
• 2.3.9 免疫组化检测小鼠脑组织（海马区和皮质区）Aβ斑块含量
• 2.4 讨论
• 2.4.1 重组蛋白具有良好的免疫原性,免疫反应偏向于Th2型
• 2.4.2 产生的Aβ特异性抗体更倾向与Aβ寡聚体结合
• 2.4.3 重组蛋白的二价疫苗潜力
• 2.4.4 使用AD模型小鼠评价重组蛋白的免疫预防效果
• 2.5 本章小结
• 3 破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病Aβ1-15表位核酸疫苗研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株、质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 引物的设计
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 抗体
• 3.1.6 动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 真核表达载体的构建
• 3.2.2 质粒的大量提取
• 3.2.3 质粒的转染
• 3.2.4 间接免疫荧光鉴定蛋白的表达
• 3.2.5 动物免疫实验
• 3.2.6 血清抗体测定
• 3.2.7 细胞免疫水平检测
• 3.2.8 斑点杂交实验
• 3.2.9 AD转基因动物免疫实验
• 3.2.10 血清抗体测定（转基因小鼠部分）
• 3.2.11 细胞免疫水平检测（转基因小鼠部分）
• 3.2.12 小鼠大脑组织的免疫组化
• 3.2.13 统计学分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 2种真核表达载体的构建
• 3.3.2 真核表达载体在BHK21细胞中的表达及鉴定
• 3.3.3 免疫小鼠血清特异性抗体水平
• 3.3.4 T细胞免疫应答反应
• 3.3.5 斑点杂交实验
• 3.3.6 ELISA法测定各免疫阶段抗Aβ的抗体水平（转基因小鼠部分）
• 3.3.7 免疫后小鼠血清抗体滴度以及抗体亚型分析（转基因小鼠部分）
• 3.3.8 T细胞免疫应答反应（转基因小鼠部分）
• 3.3.9 免疫组化检测小鼠脑组织Aβ斑块
• 3.4 讨论
• 3.4.1 重组Aβ表位DNA疫苗具有良好的免疫原性
• 3.4.2 DNA疫苗同重组亚单位疫苗之间的比较
• 3.5 本章小结
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 附A. 英文缩略词表
• 附B. 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文