论文摘要
脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作为神经生长因子家族成员，与神经系统发育有着密切关系，不仅对中枢神经元的发育、增殖分化、存活起重要作用，而且对损伤后神经元的修复与功能重塑也起重要作用。近年来神经生长因子家族一些成员纷纷被克隆并应用于中枢神经系统退行性疾病的防治。本试验目的是通过RT-PCR技术及基因克隆的方法，构建含大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）基因的真核表达载体pEGFP（N1）-BDNF，以重组质粒pEGFP（N1）-BDNF作为外源性基因，与脂质体一起转染到骨髓基质干细胞（BMSCs）中，通过荧光显微镜观察，并结合免疫荧光化学染色方法鉴定基因工程细胞是否稳定表达BDNF蛋白，同时根据免疫细胞化学染色方法鉴定BMSCs细胞能否在其表达的BDNF蛋白诱导下转变为神经细胞或神经胶质细胞。BDNF真核表达载体pEGFP（N1）-BDNF的构建：从2-3日龄大鼠脑组织中抽提总RNA，应用RT-PCR技术扩增BDNF基因片段，将此片段克隆入PMD-18-T载体，酶切反应鉴定。双酶切BDNF-T载体和空质粒pEGFP（N1），将所获目的片段和线性空载体用T4 DNA连接酶连接，构建真核表达载体pEGFP（N1）-BDNF。并进行酶切反应鉴定及DNA测序。测序结果与GenBank提供的已知序列比较，证明所克隆的BDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共750bp，与报道的序列完全相同。pEGFP（N1）-BDNF在BMSCs中的表达：首先进行骨髓基质干细胞（BMSCs）的采集与贴壁法培养，并反复传代，使BMSCs得到扩增和纯化，获得高纯度的BMSCs。然后应用脂质体转染技术将pEGFP（N1）-BDNF转染到BMSCs中，对转染细胞进行荧光显微镜观察及BDNF免疫荧光化学染色鉴定。质粒转染BMSCs 18h后，在倒置荧光显微镜下，pEGFP（N1）-BDNF和pEGFP（N1）空载体组镜下可见细胞发出绿色荧光，GFP呈阳性的BMSCs细胞数约为60％。通过BDNF蛋白的免疫荧光化学方法鉴定成功转染pEGFP（N1）-BDNF组的BMSCs，阳性BMSCs细胞数约为30％，提示BDNF在细胞中表达。转染的细胞继续培养后，通过免疫细胞化学染色结果可以看出，阳性细胞逐渐表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）。结果表明通过基因重组的方法将BDNF基因已克隆到质粒pEGFP（N1）上，采用限制性内切酶酶切和DNA序列分析鉴定表明成功构建成真核表达载体pEGFP（N1）-BDNF；采用脂质体介导的基因转染技术将pEGFP（N1）-BDNF转入BMSCs中，通过免疫荧光化学方法检测到转染后的BMSCs中有BDNF蛋白的表达；通过免疫细胞化学方法检测到转染后的BMSCs中表达神经元特异性烯醇化酶（NSE），说明BMSCs在其自身分泌的BDNF蛋白作用下，逐渐向神经元样细胞分化。
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标签：脑源性神经营养因子论文; 克隆论文; 表达论文; 脂质体论文;