论文摘要
目的本课题旨在研究Alzheimer病（AD）和血管性痴呆（Vasculardementia,VD）患者外周血中MIF、MCP-1的表达水平及其与病情程度、影响因素的关系。在此基础上,通过反复夹闭、再通双侧颈总动脉同时腹腔注射硝普钠法制造VD大鼠模型,观察VD大鼠海马组织MIF、MCP-1的表达及变化,探讨MIF、MCP-1在AD及VD中的作用及意义。方法第一章AD及VD患者外周血MIF、MCP-1的表达及其变化1.临床资料:收集我院2006年6月至2008年1月的门诊及住院AD患者64例,男性34例,女性30例,年龄53～90（75.84±8.11）岁。VD患者37例,男28例,女9例,年龄56～91（74.35±8.93）岁。对照组为同期门诊体检者50例,男性29例,女性21例,年龄53～87（72.71±9.99）岁。对照组与AD及VD组在年龄、危险因素和合并症等方面相匹配,均排除心、肝和肾等器质性病变,以及感染、自身免疫和恶性肿瘤等疾病。2.AD,VD患者以及正常对照者,均进行MMSE、ADL、HIS、GDS及抑郁焦虑量表检查,并收集临床和实验室资料,均于晨起空腹抽血。测定血浆MIF、MCP-1浓度参照ELISA试剂盒说明书操作。离心收集外周血单个核细胞（PBMC）,其MIF、MCP-1 mRNA表达水平用荧光定量PCR检测。3.用SPSS11.5 for windows软件进行统计学分析,计量数据用均数±标准差（（?）±s）表示,多个独立样本的比较用单因素方差分析;计数资料用分数表示,组间比较用x2检验,单因素相关性采用Spearman分析法,多因素回归采用多元逐步回归分析法,F引入=3.84,F删除=2.71。以P＜0.05为差异显著性检验界限第二章VD大鼠模型海马组织MIF、MCP-1的表达变化1.动物准备:二十周龄Wistar大鼠,体重300±20g,雌雄各半,由广州中医药大学实验动物中心提供,寄养于广东省人民医院医学研究中心动物中心。2.通过反复夹闭、再通双侧颈总动脉同时腹腔注射硝普钠制造VD大鼠模型,经Morris水迷宫检验大鼠的学习、记忆功能来验证模型的成功建立。按模型组、假手术组、对照组分为3组,每组8只,手术前后均进行Morris水迷宫检验。一周后处死大鼠,取脑组织,在海马区周围多点取材,每份标本一半液氮保存,用于提取蛋白及mRNA;另一半用10%中性缓冲甲醛溶液保存,制做蜡块,行HE染色和免疫组化。3.运用SPSS11.5统计软件进行统计处理,实验数据以均数±标准差（x±s）表示。定向航行实验逃避潜伏期的测量结果使用重复测量数据的多因素方差分析。空间探索实验结果使用单因素方差分析。其余统计学处理,同第一章。结果第一章AD及VD患者外周血MIF、MCP-1的表达及其变化1.MIF、MCP-1血浆的浓度和PBMC mRNA的表达水平:VD组＞AD组＞对照组,AD及VD组均高于对照组（P＜0.018）,差异有统计学意义;VD组稍高于AD组,但差异无统计学意义（P＞0.102）。2.根据简易精神状况检查量表（MMSE）评分（重度组≤10分,中度组11分～20分,轻度组21分～24分）及总体衰退量表（GDS）评分（重度组6～7级,中度组4～5级,轻度组3级）评判患者的病情程度,若两者评分不一致时取较严重的等级。将AD患者分为重度组18例,中度组33例和轻度组13例。VD患者分为重度组16例,中度组16例和轻度组5例。AD及VD患者3组不同严重程度患者MIF、MCP-1血浆的浓度和PBMC mRNA的表达水平的差异均有统计学意义。重度组显著高于轻中度组,差异有统计学意义（P＜0.041）;中度组稍高于轻度组,但差异无统计学意义（P＞0.100）（P＞0.100）。3.经逐步多元回归分析显示:MIF蛋白浓度与MMSE评分、胆固醇、C反应蛋白、MIF mRNA表达水平相关;MCP-1蛋白浓度与MMSE评分、收缩压、MCP-1mRNA表达水平相关;MIF、MCP-1蛋白浓度与与性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、高血脂病史、吸烟史、酗酒史、血沉、舒张压、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、叶酸、维生素B12均无明显相关。4.AD及VD患者MIF、MCP-1的表达与MMSE评分的相关分析:AD组血浆MIF、MCP-1的浓度（rMIF=-0.415,rMCP-1=-0.366）和PBMC mRNA的表达水平（rMIF=-0.47,rMCP-1=-0.325）均与MMSE评分呈负相关（P＜0.009）。VD组血浆MIF、MCP-1的浓度（rMIF=-0.516,rMCP-1=-0.396）和PBMC MIF mRNA的表达水平（rMIF=-0.578,rMCP-1=-0.505）均与MMSE评分亦呈负相关（P＜0.015）。第二章VD大鼠模型海马组织MIF、MCP-1的表达变化1.记忆能力测定:通过Morris水迷宫检测大鼠记忆能力,结果发现经过训练己学会游迷宫的各组大鼠中,模型组大鼠学习、记忆能力有显著的降低:在定向航行试验中,模型组与假手术组、对照组相比,逃避潜伏期显著延长（P=-0.000）;在空间探索试验中,模型组在原平台象限跨越平台次数比假手术组和对照组显著减少（P＜0.007）。但假手术组和对照组之间在这两项实验中的差异均无统计学意义（P＞0.359）。2.病理学检查结果:HE染色,200倍光镜下对照组及假手术组大鼠海马CA1区大锥体细胞排列紧密而规整,细胞核圆而大,核仁清晰。模型组大鼠海马CA1区锥体细胞层几乎完全脱失,出现大量炎性细胞浸润,亦可见锥体细胞层次断裂,神经细胞脱失现象明显,且细胞核体积变小,呈核固缩现象。3.免疫组化结果:与假手术组、对照组大鼠相比,模型组大鼠海马组织MIF、MCP-1的阳性表达增多。4.应用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR技术检测,与假手术组和对照组相比,模型组大鼠海马组织MIF、MCP-1蛋白含量及其mRNA的表达水平增高（P＜0.049）,但假手术组和对照组之间差异无统计学意义（P＞0.681）。结论1.AD及VD患者外周血MIF、MCP-1蛋白和mRNA表达水平升高,提示MIF、MCP-1参与AD及VD的发病过程,炎性反应可能是与AD及VD的发病机制之一。2.AD及VD患者病情越重MIF、MCP-1血浆浓度和PBMC mRNA表达水平越高,提示MIF、MCP-1血浆浓度和PBMC mRNA表达水平可能成为预测AD及VD病情程度的分子生物学指标,并可能对无创性动态监测AD及VD病情进展具有临床意义。3.多元逐步回归分析结果发现MIF蛋白浓度与MMSE评分、胆固醇、C反应蛋白、MIF mRNA表达水平相关;MCP-1蛋白浓度与MMSE评分、收缩压、MCP-1 mRNA表达水平相关;MIF、MCP-1蛋白浓度与性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、高血脂病史、吸烟史、酗酒史、血沉、舒张压、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、叶酸、维生素B12均无明显相关。4.VD大鼠模型海马组织MIF、MCP-1的表达增高。大鼠海马区周围有炎症反应发生及MIF、MCP-1免疫阳性细胞高表达,提示MIF、MCP-1可能是VD炎症过程中的重要炎性介质,并揭示炎症反应可能是VD的重要发病机制。5.VD大鼠模型海马区域MIF、MCP-1蛋白及其mRNA的表达增高,提示MIF、MCP-1可能参与了VD的非特异性免疫炎症反应过程,干预MIF、MCP-1表达可能是今后VD防治研究的一条新途径。
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