小麦组织培养再生相关基因克隆及分子特性分析

论文摘要

小麦组织培养高频率植株再生是小麦细胞工程育种及转基因研究的基础。一直以来,从小麦生理及培养环节出发,针对不同外植体、不同基因型进行再生性能的研究开展的比较深入,并取得了一定效果。相比之下,从分子角度进行再生性状研究,利用分子生物学手段克隆和鉴定小麦再生相关候选基因,并借助基因工程技术进行转小麦再生相关基因的功能研究相对缓慢。本研究综合本课题组在此方面的研究基础,发明了一种高效诱导小麦幼胚植株再生的培养方法;同时根据已有的文献报道及mRNA差别杂交结果,克隆到3类与小麦组织培养再生相关的候选基因,并对其进行了相关分子生物学功能鉴定,取得了如下主要结果:1.以小麦基因型中8601幼胚为试验材料,进行2,4-D中断（培养在SD0培养基上）及不中断（培养在SD2培养基上）培养,发现预培养8 d和2,4-D中断培养12 d处理显著提高小麦幼胚的再生能力,植株再生率由12.3%提高到208.2%。该方法适用于不同小麦基因型幼胚培养,一定程度减弱了小麦幼胚培养的基因型依赖性。另外,还发现温度和水分胁迫条件下生长的供体植株对小麦幼胚再生率影响明显。2.利用同源克隆方法,首次分离到小麦中亚硝酸还原酶编码基因TaNiR。BiFC分析表明,小麦TaNiR能够与铁氧还蛋白（Fd）互作。定量分析表明,小麦TaNiR表达受到KNO3诱导,胚性愈伤组织较非胚性愈伤组织表达量高。TaNiR表达也受到不同温度预处理和SD0处理的诱导。TaNiR定位表明,在小麦染色体6A和6B上各存在1个拷贝,进一步将TaNiR的1个拷贝定位于染色体6BL。启动子功能元件缺失分析表明,TaNiR启动功能较弱,其中,PNiR4区段包含TaNiR的第1个内含子,其调控功能相比其他3个片段略强。转基因功能验证,初步表明TaNiR对小麦再生有一定作用。3.通过筛选已报道的mRNA差别杂交结果,筛选到过氧化氢酶基因CAT,并克隆到小麦TaCAT3。根据第2个内含子序列,发现小麦TaCAT3存在3种类型。TaCAT2启动子序列区域存在一段类似TaCAT3第2个内含子插入机制的插入缺失突变。TaCAT1启动子功能元件缺失分析表明,TaCAT1启动子的启动功能较弱。定量分析表明,SD0、25℃培养条件、供体植株水分胁迫处理、低浓度BR对TaCATs表达具有诱导作用,同时诱发小麦愈伤组织中H2O2累积。转基因功能分析表明,TaCAT1-RNAi转化对KN199愈伤组织再生有一定抑制效果。4.克隆到3个小麦体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERKs,其中2个为全长序列（TaSERK1N,TaSERK3N）。序列及表达特性分析表明,TaSERK1N与TaSERK2N编码产物、蛋白高级结构十分相似。3个TaSERKsN在幼胚及胚性愈伤组织中表达量最高,在愈伤组织诱导阶段变化明显。水分胁迫、25℃预处理、AGP及BR处理能诱导TaSERKsN表达。染色体定位预测表明,TaSERK1N与TaSERK2N都位于小麦第2号染色体上,而TaSERK3N则可能位于第4号染色体或第5号染色体长臂的某个区域。5.从转基因植物安全性评价角度出发,构建了适合基因枪介导转化法对目标基因进行RNAi分析用载体pWMB006,双T-DNA载体pWMB014,以EPSPS基因作为筛选标记的载体pWMB025,以及包含玉米色素调控基因Lc和C1的共转化载体pWMB022。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 再生过程形态学描述
• 1.1.1 植物激素应答调控
• 1.1.2 已分化器官脱分化的分子基础
• 1.1.3 根器官建成的分子基础
• 1.1.4 芽器官发生的分子基础
• 1.2 体细胞胚胎发生的诱导因子
• 1.2.1 植物激素对再生的调控作用
• 1.2.2 胁迫诱导对再生的影响
• 1.2.3 生化物质添加对植株再生的影响
• 1.3 组织培养阶段提高植株再生的策略
• 1.3.1 基因型筛选
• 1.3.2 外植体选择
• 1.3.3 培养基成分优化
• 1.3.4 激素搭配
• 1.4 生长素的作用机制及其对再生的影响
• 1.5 再生性状细胞遗传学研究
• 1.6 提高植株再生的分子手段
• 1.6.1 再生基因分离方法
• 1.6.2 再生基因克隆研究进展
• 1.6.3 无选择标记载体系统
• 1.7 本研究的目的和意义
• 1.8 技术路线
• 第二章 小麦幼胚高效再生培养方法优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 生长素中断不同时间对小麦幼胚再生效果的影响
• 2.2.2 生长素中断处理前诱导培养不同时间对小麦幼胚再生效果的影响
• 2.2.3 生长素中断处理培养方式对不同小麦基因型再生效果的影响
• 2.2.4 不同温度预处理及水分胁迫对小麦幼胚再生效果的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 小麦TaNiR 基因克隆及分子生物学特性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 小麦TaNiR 全长克隆及5′端调控序列克隆
• 3.2.2 TaNiR 二级结构预测及高级结构同源建模
• 3.2.3 小麦TaNiR 基因进化树构建
• 3.2.4 小麦TaNiR 原核表达、半定量RT-PCR 分析及酶活性测定
• 3.2.5 TaNiR 调控序列缺失功能分析
• 3.2.6 TaNiR 与Ferredoxin 互作验证
• 3.2.7 小麦TaNiR 基因染色体定位
• 3.2.8 TaNiR qRT-PCR 分析
• 3.2.9 小麦TaNiR 转基因植株检测和初步功能鉴定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 NiR 启动子克隆
• 3.3.2 NiR 分子特性研究
• 3.3.3 NiR 生化及生理特性研究
• 第四章 小麦TaCATs 基因克隆及其分子生物学特性分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料及质粒载体
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 差异ESTs 或cDNA 半定量RT-PCR 分析
• 4.2.2 小麦TaCATs 基因全长克隆及生物学特性分析
• 2O₂ 含量测定'>4.2.3 小麦TaCATs 的qRT-PCR 分析和H₂O₂含量测定
• 4.2.4 AGP 及BR 及温度、水分胁迫处理小麦外植体对TaCATs 表达影响
• 4.2.5 小麦TaCAT1 转基因研究
• 4.3 讨论
• N基因克隆及分子生物学特性分析'>第五章 小麦TaSERKs^N基因克隆及分子生物学特性分析
• 5.1 试验材料及方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果
• N 序列分离'>5.2.1 TaSERKs^N序列分离
• N 表达特性分析'>5.2.2 TaSERKs^N表达特性分析
• N 理化特性及定位分析'>5.2.3 TaSERKs^N理化特性及定位分析
• N 进化树构建'>5.2.4 TaSERKs^N进化树构建
• 5.3 讨论
• 第六章 安全型转基因植物表达载体构建
• 6.1 试验材料及方法
• 6.1.1 质粒载体
• 6.1.2 试验方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 pWMB014 载体构建和转化验证
• 6.2.2 pWMB022 载体构建和转化验证
• 6.2.3 pWMB025 载体构建及转基因验证
• 6.3 讨论
• 第七章 全文结论
• 7.1 发现愈伤组织诱导阶段生长素中断处理显著提高小麦幼胚再生率
• 7.2 成功分离了小麦亚硝酸还原酶NiR 基因并进行了分子鉴定
• 7.3 成功分离到小麦第三类CAT 编码基因并对TaCATs 进行了分子鉴定
• N基因并进行了分子鉴定'>7.4 成功分离2 个全长的小麦SERKs^N基因并进行了分子鉴定
• 7.5 构建了4 个适合农杆菌及基因枪介导转化小麦的安全型载体
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 攻读博士期间发表及待刊论文
• 攻读博士期间申请的专利