利用多重PCR一次检测侵染大豆的几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究

论文摘要

大豆作为世界上最为重要的一种经济作物,每年在各个国家都有大宗的贸易份额,在其生长过程中会受到多种真菌、细菌、病毒、线虫、昆虫等病原物的侵染。菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）和番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus, ToRSV）均是危害大豆的重要病毒,也是我国的主要检疫对象,建立其多重PCR的快速检测体系,提高病毒的检测效率,为快验快放服务。本研究以带有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆种子为实验材料,根据BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因设计合成多对引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,同时选择大豆内源基因（BD30K）作为参照物,确保RNA提取、cDNA第一链合成及PCR等过程被正确操作,防止假阴性结果的发生。在此基础上合理组合各对引物并调整、优化多重PCR反应条件,最终确立了四对特异性引物和多重PCR的反应条件,选用的引物分别可扩增BPMV 275bp,TRSV 580bp,ToRSV 794bp,BD30K 104bp的特异性片段,反应条件则在普通PCR的基础上调整反应缓冲液浓度至1.4X,BD30K的引物浓度为其他引物的2倍,在此条件下我们建立了同时检测大豆种子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆内源基因BD30K的多重RT-PCR体系。研究结果表明,同步检测的特异性和灵敏度均好;能够检测到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最低含量分别为0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng;携带三种病毒的大豆种子混合后提取的RNA的最低检测含量为1.16ng。表明建立的多重PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可操作性强,大大缩短了检测时间,简化了操作步骤,具有较强的应用价值,适合口岸对进境大豆种子中这3种病毒的快速检测,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。本研究还建立了大豆种子中BPMV和TRSV单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受2种病毒侵染的大豆种子作为实验样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。同时将实时荧光灵敏度与DAS-ELISA和RT-PCR检测灵敏度进行比较,结果表明实时荧光PCR检测BPMV和TRSV的灵敏度分别是DAS-ELISA灵敏度的103、106倍;是双重RT-PCR灵敏度的100倍。可见双重实时荧光技术在病毒检测方面有着广阔的应用前景,同时该方法的建立在农业生产、种子流通及种子检验检疫中具有重大意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 大豆种传检疫性病毒介绍
• 1.1.1 菜豆荚斑驳病毒
• 1.1.2 烟草环斑病毒
• 1.1.3 番茄环斑病毒
• 1.1.4 南芥菜花叶病毒
• 1.1.5 南方菜豆花叶病毒
• 1.1.6 花生矮化病毒
• 1.2 植物病毒的主要检测方法
• 1.2.1 指示植物接种方法
• 1.2.2 血清学检测
• 1.2.3 电子显微镜技术
• 1.2.4 分子生物学技术
• 1.2.5 生物芯片技术
• 1.3 国内外同类研究现状分析及存在的问题
• 1.4 展望
• 第二章BPMV、TRSV、ToRSV 及大豆内源基因BD30K 质粒的制备及其多重检测技术的研究
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 大豆种子材料
• 2.1.2 试验所用的仪器及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 大豆总RNA 的提取
• 2.2.3 cDNA 的合成
• 2.2.4 PCR 扩增及产物鉴定
• 2.2.5 DNA 克隆
• 2.2.6 重组质粒的提取和鉴定
• 2.2.7 以4 种质粒为模板的PCR 检测
• 2.2.8 内源基因的选择
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 带毒大豆种子的获得
• 2.3.2 内源基因选择结果
• 2.3.3 四种质粒的单一PCR 检测结果
• 2.3.4 多重PCR 优化反应
• 2.4 讨论
• 第三章 多重RT-PCR 检测侵染大豆几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究
• 3.1 实验材料与仪器、试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 病毒接种
• 3.2.2 双抗体夹心-酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）
• 3.2.3 病毒RNA 的提取
• 3.2.4 单一RT-PCR 反应
• 3.2.5 多重RT-PCR 反应
• 3.2.6 灵敏度试验
• 1)DAS-ELISA 方法的灵敏度试验
• 2)RT-PCR 的灵敏度试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 DAS-ELISA 检测
• 3.3.2 单一RT-PCR 检测
• 3.3.3 多重RT-PCR 检测
• 3.3.4 单项RT-PCR 与多重RT-PCR 敏感性试验
• 3.3.5 DAS-ELISA 方法的灵敏度检测
• 3.3.6 RT-PCR 的灵敏度检测
• 3.4 讨论
• 第四章 单管实时荧光 RT-PCR 方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒
• 4.1 材料与设备
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器和试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 引物和探针的设计及合成
• 4.2.2 BPMV 和TRSV 的单一实时荧光RT-PCR 检测
• 4.2.3 BPMV 和TRSV 引物和探针的特异性实验
• 4.2.4 BPMV 和TRSV 两种病毒的单管双重实时荧光RT-PCR 检测
• 4.2.5 双重实时荧光PCR 特异性测试
• 4.2.6 灵敏度对比实验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 BPMV 和TRSV 引物及探针的特异性测试
• 4.3.2 实时荧光PCR 灵敏度检测
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录A：常用缩略语表
• 附录B：常用生化试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录C：主要试剂的配制
• 致谢