论文摘要
运用双层平板从土壤中筛选得到两株能溶解金黄色葡萄球菌和变形链球菌的链霉菌,一株为球孢链霉菌S186,一株为灰色链霉菌S106,并已从S106基因组中克隆得到N,O-二乙酰胞壁质酶的成熟肽基因。根据作用于肽聚糖上不同的位点,溶菌酶可以分为胞壁质酶,内肽酶,N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰酰胺酶等。胞壁质酶,内肽酶,N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰酰胺酶不仅可以裂解金黄色葡萄球菌和变形链球菌,而且在微生物细胞壁的生长及分裂中起重要作用。所以,拟从S106基因组中克隆出内肽酶或酰胺酶的基因并进行原核表达及酶性质研究。从NCBI的蛋白质数据库中,搜索得到了链霉菌内肽酶和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的序列,运用Clustw进行比对,并结合CDD数据库,选择合适的保守区,在线设计CODEHOP引物,运用CODEHOP PCR技术从链霉菌S186和S106的基因组中克隆出了内肽酶和酰胺酶的部分基因片段,将扩增得到的片段连接至pUcm-T载体,并转化大肠杆菌DH5a,筛选转化子,并进行测序分析。结果显示,克隆得到的序列与链霉菌的内肽酶和酰胺酶序列有很高的同源性。根据CODEHOP扩增得到的基因片段设计嵌套引物,运用TAIL-PCR技术扩增出了S106中内肽酶保守区的5′端和3′的序列,拼接得到了内肽酶基因pR4的全长基因,分析结果表明,pR4酶基因全长71 1bp,编码237个氨基酸,为肽酶23/37家族成员,与天蓝色链霉菌中的一个肽酶基因的相似性达69%,并运用生物学软件分析了基本的酶学性质和信号肽序列,结果显示,pR4酶为一个典型的分泌型蛋白,信号肽长39个氨基酸,成熟肽197个氨基酸,分子量为19971.10Da,等电点为9.57,并将成熟肽命名为R4基因,另外还对包括pR4在内的50个物种肽酶进行了氨基酸序列的比较,分析了pR4基因在内肽酶系中的进化地位。设计引物自S106的基因组扩增得到R4基因,并通过合适的酶切位点将R4基因连接至表达载体pET-26b（+）,构建了pET-26b（+）-R4重组质粒,并转化EcoliBL21（DE3）plySs,通过菌落PCR和测序验证,得到了转内肽酶R4基因的工程菌,重组菌经IPTG诱导后大量表达重组的内肽酶,对表达结果进行了SDS-PAGE分析和酶活性分析。结果显示,内肽酶的溶菌活性较低,但这可能一方面使由于内肽酶本身的溶菌活性就很低,另一方面可能是由于没有找到合适的底物和反应条件所致。此外还对实验室已经研究过的R2基因的上游调控序列进行了初步研究,运用TAIL-PCR技术克隆得到了一段序列,该段序列包括R2信号肽序列,部分的氧化还原酶基因序列和302bp的两个ORF之间的间隔序列。对302bp的间隔序列进行分析,未发现明显的启动子特征,是否具有启动子活性还有待进一步研究。