论文摘要
胰腺癌由于其起病隐匿、易转移、解剖位置复杂、手术困难、对放化疗不敏感等原因,已经成为重要的致死性癌症,寻找有效的基因治疗方法是改善胰腺癌预后的重要措施之一。本研究观察RNA干扰（RNA interference,RNAi）同时抑制胰腺癌中两个关键性癌基因K-ras和AKT2对于胰腺癌细胞系Panc-1细胞生长和凋亡的影响,探讨其作用机制,为胰腺癌的临床治疗提供新的方法。本研究主要进行了以下几方面的工作:一、构建并筛选单干扰和双干扰重组质粒载体1.根据invitrogen公司提供的网上设计工具,设计了两对针对K-ras的干扰序列;连接进入载体后,测序鉴定。2.设计了四对针对AKT2的干扰序列;连接进入载体后,测序鉴定。3.瞬时转染人胰腺癌细胞系Panc-1细胞,筛选出有效的抑制K-ras或AKT2的重组质粒载体。4.采用限制性内切酶方法构建双干扰重组质粒载体。二、重组质粒载体降低相关癌基因mRNA和蛋白的表达1.重组质粒anti-kras可以有效和特异性地减少胰腺癌细胞系Panc-1细胞中K-ras mRNA和蛋白的水平。2.重组质粒anti-akt2可以有效和特异性地减少胰腺癌细胞系Panc-1细胞中AKT2 mRNA和蛋白的水平。3.重组质粒anti-k+a和anti-a+k可以有效和特异性地减少胰腺癌细胞系Panc-1细胞中K-ras和AKT2 mRNA和蛋白的水平。三、重组质粒减缓细胞生长,促进细胞凋亡1.CCK-8方法检测细胞生长曲线。结果显示,相对于未处理组和阴性载体对照组,所有重组质粒的稳定转染细胞生长均减慢,双干扰重组质粒组的生长受抑最显著,与单干扰重组质粒组相比具有统计学差异。2.克隆形成试验检测细胞的生长增殖能力。结果显示,相对于未处理组和阴性载体对照组,所有重组质粒组的克隆形成能力均下降,双干扰重组质粒组的下降最显著,与单干扰重组质粒组相比具有统计学差异。3.Heochst方法检测细胞凋亡时细胞核形态的改变。结果显示,相对于未处理组和阴性载体对照组,所有重组质粒转染的细胞均出现凋亡小体,双干扰重组质粒组与单干扰质粒组相比,凋亡小体数目增多显著。4.Annexin V-FITC/PI法检测细胞的早期凋亡。结果显示,相对于未处理组和阴性载体对照组,所有重组质粒转染的细胞均出现凋亡,双干扰重组质粒组凋亡细胞比例最高,与单干扰重组质粒组相比具有统计学差异。5.Caspase-3法检测细胞的凋亡状态。结果显示,相对于未处理组和阴性载体对照组,所有重组质粒转染的细胞均出现凋亡蛋白的激活,双干扰重组质粒组凋亡蛋白激活最显著,与单干扰重组质粒组相比具有统计学差异。四、重组质粒载体降低p-ERK和p-GSK激酶磷酸化水平,减少癌蛋白c-myc含量1.单干扰重组质粒anti-kras转染后可以有效降低信号通路RAS/MAPK中p-ERK激酶磷酸化水平。2.单干扰重组质粒anti-akt2转染后可以有效降低信号通路PI3K/AKT中p-GSK激酶磷酸化水平。3.双干扰重组质粒anti-k+a转染后可以有效降低信号通路RAS/MAPK中p-ERK激酶磷酸化水平和PI3K/AKT中p-GSK激酶磷酸化水平。4.单干扰重组质粒anti-kras、anti-akt2转染后可以有效降低c-myc蛋白表达;双干扰重组质粒anti-k+a转染后也可以明显降低c-myc蛋白表达,与单干扰重组质粒相比,具有统计学差异。五、重组质粒载体对动物体内移植瘤生长的影响1.将各种重组质粒的稳定转染细胞和未处理细胞接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力。结果显示,与未处理组和阴性载体稳定转染细胞系相比,单干扰和双干扰稳定转染细胞系肿瘤生长缓慢,且双干扰稳定转染细胞系肿瘤细胞生长要慢于单干扰组。2.预先在裸鼠背部皮下种植成瘤,采用PEI转染方法,多点肿瘤内注射两次,观察肿瘤的生长情况,结果显示,与未处理组和单独PEI转染组相比,单干扰处理组肿瘤生长减缓,双干扰处理组肿瘤生长减缓更显著,与单干扰组比较具有统计学差异。我们的研究表明RNA干扰技术是一种十分有效的基因治疗方法,联合抑制原癌基因K-ras和AKT2可使胰腺癌细胞的生长代谢受到明显的抑制、促进胰腺癌细胞的凋亡;体内实验结果显示联合干扰可以有效抑制肿瘤细胞生长、使其丧失致瘤能力;联合干扰发挥作用的可能机制是同时阻断了两条信号通路RAS/MAPK和PI3K/AKT,诱导促凋亡蛋白BAD发挥促进细胞凋亡作用以及促进c-myc蛋白的降解。本研究的创新点在于采用RNA干扰技术联合抑制两个原癌基因探讨胰腺癌的基因治疗。
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