水稻脂肪氧化酶RNA干扰载体的构建及转化水稻进行耐储藏的研究

论文摘要

粮食安全是一个全球性的战略问题,是关系到国家乃至世界政治稳定和经济发展的大事。我国有65%以上的人口以大米为主食,水稻担当着我国粮食安全的第一重任,而粮食贮备又是其中重要的一环。我国每年因稻谷陈化问题损失的包括作为食用和种用的稻谷占总产量的3},造成几十亿元的经济损失。稻谷在一般贮藏条件下第二年就会产生陈化变质现象,高温高湿地区则更快。为此,我国储备粮通常采用分散分批、定期推陈储新、轮流更新的方法,耗费了大量的人力、物力和财力。近年来的研究表明,稻谷贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生陈味的主要原因之一,其中脂氧合酶是脂质降解的关键酶。因此从理论上讲,lox的缺失可以明显地阻止脂质过氧化作用,减缓贮藏粮食氧化变质的速度,保持清新气味,提高耐贮性。通过搜索genbank数据库,设计引物。通过PCR技术从玉米和水稻DNA中分别克隆了玉米泛素启动子（Ubi组成型）和水稻种子脂肪氧化酶基因的特异启动子（SL特异型）、玉米泛素第一个内含子（IN）。从植物真核表达载体PBI121上克隆终止子NOS。克隆的玉米泛素启动子与已知的序列同源性为99.6%,其它序列同源性均为100%。通过比对多种植物的LOX基因,找到同源性比较高的序列。利用RT-PCR技术从水稻总RNA中克隆得到了一对反向互补序列的LOX基因片段（G1和G2）。为了确定我们克隆的玉米泛素启动子是否有活性。我们用玉米泛素启动子替代了植物真核表达载体PBI121中的35S启动子, GUS染色结果显示此启动子的活性很高。利用植物真核表达载体PCAMBIA1301和上述片段,通过构建中间载体的方法,使构建过程简单化,构建了两个植物RNAi表达载体,并通过酶切检测可知构建成功,两个载体含有如下部分:1) p13UL,含玉米泛素启动子、含内含子的lox cDNA发夹结构及潮霉素选择标记基因hpt; 2) p13SL,含水稻种胚脂肪氧化酶基因的特异启动子、含内含子的lox cDNA发夹结构及潮霉素选择标记基因hpt。利用农杆菌转化法将p13UL和p13SL两个载体分别转化到水稻愈伤组织中。得到再生植株,得到的再生植株品系均为中花16号。PCR检测基因组DNA显示,转p13SL载体的14株转基因植株中得到4株阳性植株,转p13UL载体的6株转基因植株中得到3株阳性植株。这说明两个载体都插入水稻基因组中。为了研究插入基因组的RNAi片段是否可以表达并起到基因敲除的作用,我们利用了伤害可以诱导LOX基因大量表达这一特性,对转入p13UL的阳性转基因植株进行伤害诱导,并利用半定量RT-PCR分析其表达量,结果显示,对照组在进过伤害诱导后LOX基因表达水平明显增加。而实验组进过伤害诱导后LOX基因表达水平也有所增加,但是增加量明显比对照组少。以上试验说明我们插入水稻中LOX发卡结构起到了RNA干扰的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 植物脂肪氧化酶研究进展
• 1.1.1 脂肪氧化酶及其与谷物陈化的关系
• 1.1.2 脂肪氧化酶在植物中的细胞定位和活性
• 1.1.3 LOX 以及LOX1、2、3 主要存在的部位和表达的时间
• 1.1.4 脂肪氧化酶的氧化途径
• 1.1.5 脂肪氧化酶的测定方法
• 1.1.6 脂肪氧化酶的生化特性
• 1.1.7 脂肪氧化酶的生理学功能
• 1.1.8 脂肪氧化酶基因及其表达
• 1.1.9 脂肪氧化酶与稻谷耐贮特性
• 1.1.10 今后研究重点
• 1.2 水稻脂肪氧化酶
• 1.2.1 水稻脂肪氧化酶缺失的效果
• 1.2.2 水稻种胚LOX 与叶片LOX 同工酶的差异
• 1.2.3 国内研究进展
• 1.3 RNA 干涉研究进展
• 1.3.1 RNA 干涉的概况
• 1.3.2 RNA 干涉的发现
• 1.3.3 RNA 干涉的机制
• 1.3.4 RNA 干涉的生物学意义
• 1.3.5 RNA 干涉的特点
• 1.3.6 RNA 干涉在基因功能研究中的应用
• 1.4 本论文的研究目的和研究内容
• 1.4.1 研究目的和意义
• 1.4.2 本论文的研究内容
• 1.4.3 本论文的研究技术路线
• 1.5 本论文研究的创新点
• 2 构建 RNAi 载体各个片段的克隆及玉米泛素启动子功能的瞬时检测
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验植物
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻、玉米基因组DNA 的提取
• 2.2.2 水稻新生苗总RNA 的提取
• 2.2.3 农杆菌中PBI121 和pCAMBIA-1301 质粒的提取
• 2.2.4 构建p13UL、p13SL RNAi 载体各个片段的克隆及序列分析
• 2.2.5 玉米泛素启动子功能的瞬时检测
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 水稻、玉米基因组DNA 的提取
• 2.3.2 水稻新生苗总RNA 的提取
• 2.3.3 构建p13UL、p13SL RNAi 载体各个片段的克隆及序列分析
• 2.3.4 玉米泛素启动子功能的瞬时检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 构建p13UL、p13SL RNAi 载体各个片段的克隆
• 2.4.2 玉米泛素启动子功能的瞬时检测
• 3 植物 RNAi 表达载体 p13UL 和 p13SL 的构建
• 3.1 试验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物RNAi 表达载体p13UL 的构建
• 3.2.2 植物RNAi 表达载体p13SL 的构建
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 植物RNAi 表达载体p13UL 的构建
• 3.3.2 植物RNAi 表达载体p13SL 的构建
• 3.4 讨论
• 4 根癌农杆菌介导 p13UL、p13SL 表达载体转化水稻
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 生物材料
• 4.1.3 培养基
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 植物表达载体转化农杆菌
• 4.2.2 根癌农杆菌转化水稻愈伤步骤同2.2.5
• 4.2.3 水稻胚性愈伤组织的诱导、根癌农杆菌的培养、洗除农杆菌步骤同2.2.5
• 4.2.4 抗性愈伤的筛选
• 4.2.5 抗性愈伤的分化培养与再生
• 4.2.6 转基因植物的PCR 及半定量RT-PCR 鉴定
• 4.3 结果和分析
• 4.3.1 重组农杆菌的菌落PCR 鉴定
• 4.3.2 抗性愈伤的筛选
• 4.3.3 抗性愈伤的分化培养与再生
• 4.3.4 转基因植物的鉴定
• 4.4 讨论
• 5 结论和后续工作建议
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录
• B. 作者在攻读学位期间在 Genbank 中登陆的序列号