SOCS在原发性胆汁性肝硬化发病机制中的作用研究

论文摘要

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）是一种慢性炎症性、进行性肝内胆汁淤积性自身免疫性肝病,以血清中出现抗线粒体抗体（antimitochondrialantibody,AMA）和导致胆汁淤积性肝硬变的肝脏门脉周刚淋巴细胞浸涧、小胆管特异性破坏为特征,最终发展成肝硬化和肝衰竭。PBC的病因和确切发病机制至今尚不完全清楚,可能与遗传因素、病毒和细菌感染、自身免疫状态及环境因素等有关。可能的发病机理是:机体对自身抗原的耐受性被打破,致使肝内中、小胆管上皮细胞不断受到免疫系统的攻击而引起胆汁淤积最终发病。但是,诱发自身免疫应答的始动因素和自身免疫耐受破坏的机制尚不清楚。在过去的十几年里,对PBC的细胞免疫研究主要在外周血不同T细胞亚群,如Th1、Th17和CTL的研究。而对免疫耐受起关键作用的树突状细胞（dendritic cell,DC）的功能研究非常少,可能是受到DC标本来源以及培养技术的限制。DC是目前所知的机体内功能最强的抗原递呈细胞,它不仅是机体免疫应答的始动者,而且在诱导免疫耐受、调节T细胞介导的免疫应答方面都发挥着关键的作用。JAK-STAT途径是一条多种细胞因子共用的信号传导途径,在很多慢炎症性疾病特别是有自身免疫因素参与的疾病中发挥重要的作用。细胞因子信号转导抑制分子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）是由细胞因子诱导产生的,在JAK-STAT信号和Toll样受体（toll like receptor,TLR）通路中重要的负调控蛋白,可以避免机体的过度免疫反应。SOCS可以负调控巨噬细胞和树突状细胞的激活,并参与T细胞的分化和免疫调控等活动,是机体免疫调控系统的重要组成成份。SOCS1是DC介导的T细胞激活和保持免疫耐受的必须的负调控蛋白。目前通过动物实验已经证实SOCS可以治疗许多有细胞因子信号通路参与的感染性和免疫性疾病,推测SOCS对自身免疫性疾病的治疗具有一定的作用。迄今为止,JAK-STAT-SOCS通路在PBC发病过程中的作用缺乏研究,细胞因子的变化与SOCS的负调控作用是否有关?PBC病人中DC的功能研究也非常少,那么PBC免疫耐受的破坏是否与SOCS介导的DC功能变化有关?基于以上国内外的研究现状和存在问题,本课题拟通过测定PBC病人血清中炎性细胞因子的变化,外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）SOCS的变化,并利用PBMCs诱导和培养树突状细胞,观察SOCS对DC功能的影响,来进一步研究SOCS在PBC发病机制中的作用,从而为PBC的免疫学治疗提供一个新的靶点。第一部分原发性胆汁性肝硬化患者血清学中炎性细胞因子的变化机体免疫系统的自身调节网络依赖于促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡,当这种平衡被打破,就会引起自身免疫现象,检测细胞因子的变化可以反映机体的炎性状态和免疫状态。研究对象为78例PBC病人,30例慢性乙肝病人（chronic hepatitis Bvirus,CHB）和60例健康对照者（healthy control,HC）。ELISA检测促炎细胞因子[IL-6,IL-17,Interferon-gamma（IFN-γ）]和抗炎细胞因子（IL-10,TGF-β）,免疫比浊法检测CRP的变化。结果显示与健康组相比,PBC病人的IL-6,IL-17A,IFN-γ和IL-10血清学水平显著升高（P<0.05）,TGF-β水平在PBC和HC组之间无显著性差异;但与CHB组相比,PBC病人的IL-6和TGF-β水平显著降低（P<0.05）,IL-17A水平要显著性升高（P<0.05）,IFN-γ和IL-10的血清学水平无显著性差异。Hs-CRP在PBC血清中含量显著高于HC组;但与CHB组相比,PBC的hs-CRP要显著降低（P<0.05）。验证了PBC病人处于慢性炎性状态。第二部分PBC患者外周血中TLR和SOCS的表达TLRs通路活化可以诱导某些细胞因子的产生增加,不仅能诱导自身免疫,而且能调节免疫耐受。SOCS1和SOCS3是调节细胞因子和TLR通路中最重要的两个因子。本部分主要检测外周血中TLR和SOCS的mRNA水平以及SOCS的蛋白水平,来研究SOCS在PBC外周血中的变化。1、PBC患者PBMCs中TLR和SOCS mRNA水平的表达外周血分离PBMCs,抽提细胞总RNA,建立RT-PCR方法,测定了32例PBC,30例CHB和32例HC组PBMCs的TLR4、TLR9、SOCS1、SOCS3的表达。结果发现,与HC组相比,PBC病人的TLR4、TLR9、SOCS1和SOCS3 mRNA的水平均显著性高于HC,为HC组的1.48、2.51、3.43和1.48倍（P<0.05）,TLR9和SOCS1的mRNA水平是CHB的6.85倍和2.99倍（P<0.05）。2、PBC患者PBMCs中SOCS在蛋白水平的表达利用Western-blot方法检测PBC患者和健康对照者PBMCs中SOCS1和SOCS3在蛋白水平上的表达,结果显示,SOCS1和SOCS3在PBC患者PBMCs中表达明显高于健康对照者。上述发现证实了TLR-SOCS通路在自身免疫性疾病中的作用,本实验中TLR4和TLR9在PBC病人中的显著升高说明TLR过度激活,这与PBC的发生可能有一定关系,而SOCS作为多条信号通路中的负调控因子,虽然表达也升高,但不能完全抑制细胞因子和TLR通路的过度激活作用,推测SOCS在PBC发病过程中的负反馈效应发挥的不够。第三部分PBC患者外周血来源的DC中SOCS的表达及其作用我们前两部分的研究表明PBC病人处于慢性炎性状态,SOCS在外周血中表达升高,并不能完全抑制细胞因子和TLR通路的过度激活作用。既然SOCS在DC中高表达,那么SOCS是否会引起PBC病人的DC的功能变化从而诱导免疫耐受的变化?基于这些疑问,我们通过10例PBC的病人,8例HC,PBMCs诱导和培养DC,观察SOCS在PBC病人DC中的变化,以及DC的表型和分泌细胞因子的变化,来阐述SOCS在PBC发病机制中的作用。1、流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析DC表型用FCM分析PBC病人DC的细胞表型,结果显示CD83,CD86和HLA-DR的表达率分别为:（79.4±4.8）%,（86.5±6.3）%和（90±3.5）%,与HC组的表达率[（68.3±4.1）%,（74.2±6.3）%和（83.6±7.6）%]相比,三者均显著性升高（P<0.05）。2、ELISA检测DC培养上清中细胞因子含量的变化PBC病人的DC分泌的细胞因子IL-10,IL-12和IFN-γ分别为:（7.0±4.6）pg/ml,（53 5±11.1）pg/ml和（32.0±9.0）pg/ml,与HC组[（5.8±4.2）pg/ml,（32.1±10.7）pg/ml和（15.4±8.1）pg/ml)]相比,IL-12和IFN-γ显著性升高（P<0.05）,而IL-10在两组之间无显著性差别（P>0.05）。3、Western blot测定DC中SOCS1和SOCS3的变化结果显示SOCS1和SOCS3在PBC患者外周血PBMCs诱导培养的DC中表达明显低于健康对照者。本部分研究说明PBC患者体内DC可能更倾向于成熟状态,通过DC表面CD86等协同刺激分子的差异表达,使抗原递呈能力明显增强,IL-12和IFN-γ的分泌增加更容易诱导Th1细胞的活化,使机体内免疫反应产生过度,导致了机体内免疫平衡的紊乱和免疫耐受的破坏,从而诱发了自身免疫性疾病。第四部分线粒体M2蛋白通过SOCS1通路对DC的作用PBC的主要免疫学指标是AMA阳性,其血清阳性率可达90%以上,而抗M2亚型抗体是PBC的特异性抗体。我们在第三部分发现PBC外周血来源的DC中SOCS的表达降低,与外周血的升高不一致,那么SOCS在PBC发病过程中通过何种途径发挥作用?以及线粒体M2蛋白是否会通过活化JAK-STAT-SOCS途径,并激活DC,从而参与T细胞的激活和细胞因子的分泌?为回答这些疑问,我们在体外诱导和培养健康献血者外周血全白细胞来源的DC,利用SOCS1的RNA干扰实验,并在M2蛋白刺激下,模拟PBC的发病情况,探讨SOCS1对DC功能的影响。1、SOCS1 SiRNA的转染和抑制效率利用荧光染料FAM标记的阴性对照可以判断SiRNA转染效率。转染6h后,通过荧光显微镜和流式细胞术检测,SiRNA的转染效率很高,可以达到95%左右,说明转染成功。用RT-PCR检测其抑制效率,发现SOCS1-156抑制效率最高,在mRNA水平可以抑制85%。2、FCM测定DC表面CD83和CD86的表达结果显示DC在M2蛋白浓度为70μg/ml刺激24 h,35μg/ml刺激24 h、48 h和72 h时,CD83和CD86的表达率都显著性高于control组;二者的表达率在（SiRNA+M2）组的不同刺激浓度和时间点均高于M2刺激组（P<0.05）。3、ELISA测定DC培养上清IL-12和IL-10的变化结果显示DC在M2蛋白浓度为70μg/ml刺激24 h,35μg/ml刺激24、48和72h时,与对照组相比,二者水平均升高（P<0.05）;而在（SiRNA+M2）组,发现各个刺激浓度和时间点的IL-12水平均显著性高于M2刺激组,其中在35μg/ml刺激48h时IL-12水平达到最高（P<0.05）,而IL-10在两组各刺激浓度和时间点之间无显著性差异（P>0.05）。4、Western blot检测DC中SOCS和STAT的变化结果显示SOCS1干扰后DC再接受不同浓度和时间的M2刺激后,SOCS1的表达均明显下降;p-STAT1表达升高;而SOCS3和p-STAT3的变化在两组之间没有明显变化。说明DC在接受高浓度的M2刺激后,其抗原递呈和Th1的极化能力增强;而SOCS1被抑制后再接受M2刺激,发现STAT1的活化程度增加,CD83,CD86和IL-12的均升高,这与第三部分PBC病人DC中SOCS1表达降低,免疫耐受破坏和递呈功能增强相一致。本研究我们从负调控的角度首次研究了SOCS在PBC发病机制中的作用,初步认为SOCS在外周血的表达升高是由细胞因子和TLR激活引起的被动性升高,但其升高并不能完全抑制机体的过度免疫反应;而在DC中的低表达与DC的成熟,抗原递呈和诱导Th1细胞的极化能力增强有关,这些变化引起机体免疫耐受的破坏,并产生过度的免疫应答和免疫平衡的紊乱,最终诱导PBC的发病。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写及中英文对照表
• 前言
• 第一部分 原发性胆汁性肝硬化患者血清学中炎性细胞因子的变化
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分 PBC患者外周血中TLR和SOCS的表达
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第三部分 PBC患者外周血来源的DC中SOCS的表达及其作用
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第四部分 线粒体M2蛋白通过SOCS1通路对DC的作用
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述一 原发性胆汁性肝硬化发病机制研究进展
• 综述二 SOCS及其免疫学作用研究进展
• 论文发表情况
• 参加学术会议
• 致谢