鸭白细胞介素2配体与受体alpha的研究

论文摘要

基于鸡白细胞介素2（chIL-2）全基因序列设计引物探针，以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板，用长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）扩增鸭白细胞介素2（duIL-2）全基因片段，得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因结构、启动子结构和预测的成熟蛋白进行系统分析，在此基础上对推测的duIL-2蛋白的三维结构分子模型进行了构建。结果表明：duIL-2基因具有典型的4外显子3内含子结构，与已知的鸡和哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性；鸭和鸡及其它哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性，都具有AP-1，NF-AT，CD28RE，OCT，TATA box转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点；推测的duIL-2基因的阅读框长420bp，编码一条由140个氨基酸组成的多肽；duIL-2基因推测的成熟蛋白进化分析表明，鸭和鹅的亲缘关系最近，和哺乳动物的亲缘关系比较远，显示出明显的种属差异；三维结构预测表明，duIL-2蛋白具有典型的四alpha螺旋捆绑结构。以RT-PCR方法克隆的鸭白介素2的cDNA为模板，PCR扩增鸭IL-2成熟蛋白的编码序列。将此序列插入pBAD／HisB和pET28a原核表达载体多克隆位点，构建pBAD／HisB-duIL-2和pET28a-duIL-2重组子，分别转化大肠杆菌LMG194和BL21（DE3）宿主菌，经阿拉糖和IPTG诱导，实现了鸭白介素2蛋白（rduIL-2）体外重组表达。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白的分子量约分别为18.7KDa和14.6KDa。Western Blot分析表明，表达的重组蛋白能分别被anti-Xpress和anti-His单克隆抗体识别。以pET28a系统表达的rduIL-2蛋白为原材料，尝试了两种复性策略制备复性rduIL-2蛋白结构单体：一种是借助梯度稀释对变性纯化的rduIL-2单体进行复性；一种是借助FPLC对非变性纯化的rduIL-2单体进行简易氧化复性。前者的复性产物中含有rduIL-2多聚体和单体两种形式，且产率很低。后者可以获得高产量的复性单体。PF-2D分析表明复性单体等电点为3.4，反相二维色谱没有分离到潜在的异构体。非变性条件制备的rduIL-2复性单体4℃存放一周没有形成沉淀，而变性复性策略获得复性产物则形成可见絮状沉淀。以纯化的rduIL-2免疫BALB／c小鼠，将其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，成功获得5株能分泌抗鸭IL-2蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞系：1H4、283、4G12、5F6和5H6。除mAb 5H6为IgG2a亚类外，其余4株mAb类型均为lgG1亚类，5株mAb的轻链都为κ链。Western-blot分析表明，所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性，其中5H6对鸡IL-2具有交叉反应性。细胞免疫化学分析表明，单克隆抗体283、4G12、1A4以及多抗均能够识别真核细胞瞬时表达系统表达的鸭重组IL-2。体外阻断实验证明，mAb 2B3能够明显抑制duIL-2对鸭脾细胞的增殖效应。以rduIL-2复性单体为活性标准品，进行了鸭白介素2体内外生物学活性研究：用MTT法测定了rduIL-2的体外淋巴细胞增殖活性；以鸡为模型，静脉注射rduIL-2，观察其体内生物学效应；研究了rduIL-2蛋白对重组禽流感灭活疫苗免疫效力的影响。结果表明：rduIL-2复性单体能刺激T淋巴细胞增殖，且呈剂量依赖性；高剂量连续注射rduIL-2引起鸭发热、多脏器炎症等毒副作用；鸡静脉注射低rduIL-2（0.1-25μg）后，其CD4+T细胞上调，且上调水平与注射剂量没有直接相关性，而CD8+T细胞含量变化不明显。低剂量的鸭IL-2能够明显提高重组禽流感灭活疫苗HI效价，而剂量过高则会抑制重组禽流感灭活疫苗免疫效力。根据鸡白介素2受体alpha链（ChlL-2Rα）cDNA序列设计多对引物探针，结合RACE技术克隆了duIL-2受体alpha cDNA（命名为DuCD25或者duIL-2Rα）。克隆的cDNA序列长886bp，其cDNA编码一条由226个氨基酸组成的前体蛋白，该前体蛋白含有由20aa残基构成的信号肽序列；预测的duIL-2Rα成熟蛋白与鸡IL-2Rα同源性61％，与哺乳类同系物同源性在15-25％之间。对10个物种IL-2Rα氨基酸序列分析发现，禽类和哺乳类有23个aa对应位点完全保守。duIL-2Rα的8个半胱氨酸残基中，有7个对应位点与鸡和哺乳类完全保守；我们也发现，哺乳类IL-2Rα的P24-P25、N90-A91、P111-K112、1185-R186位点之间和胞内羧基末端，在进化过程中分别出现了1、3、1、26-29和9-16个氨基酸插入现象，然而在进化过程中，哺乳类IL-2Rα并没有发生任何aa残基缺失的现象。二级结构分析表明，duIL-2Rα成熟蛋白羧基末端含有25个氨基酸残基（182-206）构成的跨膜区。将duIL-2Rα胞外链PCR产物亚克隆入原核表达载体pET32a，构建重组表达载体pET32a-duIL2Rα，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导实现了duIL2Rα蛋白在大肠杆菌的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达蛋白的分子量约为40KDa，可以被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明，经pET32a系统表达的duIL-2Rα主要以包涵体的形式存在。表达的重组蛋白经Ni2+层析柱变性纯化产率极低，采用制备包涵体的方法，每升培养液中可获得32mg rduIL2Rα蛋白粗制品。用纯化的rduIL-2Rα包涵体蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，最终获得15株持续、稳定分泌抗rduIL-2Rα原核表达产物的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3，6H7（抗体类型均为IgG1，κ）。对15株单抗Western blot鉴定结果表明，与rduIL-2Rα均具有反应性。细胞免疫化学分析表明，仅有5株（1A4，3H11，4G10，3D1，6F2）能够特异识别经Vero细胞瞬时表达的duIL-2Rα蛋白。进一步利用Con A诱导的内源性duIL-2Rα作为抗原，筛选到两株能够识别duIL-2Rα天然表位的抗体（3H11，6F2）。利用H9N2亚型禽流感病毒感染模型，以rduIL-2 Rα单克隆抗体6F2为检测抗体，借助流式细胞术，研究了鸭DuCD25+细胞在病毒感染免疫应答中的表达动态。结果表明，健康鸭脾细胞仅有少量DuCD25+细胞（＜4％），而感染鸭脾细胞中的DuCD25+细胞比率以固定斜率直线式迅速上调，到48h达到峰值，随后逐渐下降，至感染后144h降至正常水平，说明DuCD25+细胞在机体抗病毒感染的免疫应答过程中扮演着重要角色。

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Abstract

论文创新点

研究内容

第一章鸭白介素2基因克隆与生物信息学分析

1 材料

2 方法

2.1 鸭白介素2基因组克隆

2.2 鸭白介素2生物信息学分析

3 结果

3.1 duIL-2全基因DNA片段扩增和序列测定

3.2 duIL-2基因结构

3.3 duIL-2基因的启动子调节位点

3.4 鸭和其他动物IL-2氨基酸同源性分析

3.5 duIL-2成熟蛋白进化树分析

3.6 IL-2蛋白的三维结构预测

4 讨论

第二章不同原核系统对重组鸭白介素2的表达

1 材料

2 方法

2.1 脾淋巴细胞的诱导培养及总RNA的抽提

2.2 RT-PCR

2.3 鸭IL-2 cDNA克隆及鉴定

2.4 重组载体构建及鉴定

2.5 rduIL-2的诱导表达

2.6 SDS-PAGE与Western blot鉴定

2.7 变性纯化

2.8 天然纯化

2.9 FPLC纯化单体

2.10 rduIL-2复性

2.11 天然电泳分析

2.12 PF-2D分析

3 结果

3.1 RT-PCR产物的克隆及鉴定

3.2 重组表达质粒的构建与鉴定

3.3 SDS-PAGE鉴定

3.4 Western blot鉴定

3.5 rduIL-2产物的纯化

3.6 可溶性rduIL-2单体的分离

3.7 rduIL-2复性

3.8 等电点与异构体分析

4 讨论

第三章抗重组鸭IL-2抗体的制备与鉴定

1 材料

1.1 实验动物、生化试剂及培养基

1.2 抗原和抗体

2 方法

2.1 单克隆抗体的制备

2.2 duIL-2多抗血清的制备

2.3 抗原捕获ELISA

2.4 识别真核表位抗体鉴定

2.5 抗体抑制实验

3 结果

3.1 单克隆抗体制备

3.2 单克隆抗体亚类及腹水效价检测

3.3 抗duIL-2多克隆抗体效价测定

3.4 抗原捕获ELISA

3.5 抗duIL-2单克隆和多克隆抗体功能鉴定

4 讨论

第四章鸭白介素2生物学活性与毒副作用

1 材料

2 方法

2.1 IL-2的制备

2.2 DuIL-2 DNA质粒大量制备、鉴定和浓度测定

2.3 体外生物学活性

2.4 体内生物学活性

2.5 体内毒性研究

2.6 rduIL-2,duIL-2 DNA载体对AIV油乳剂灭活苗免疫效力的影响

3 结果

3.1 rduIL-2蛋白的体外生物学活性

3.2 rduIL-2蛋白的体内生物学活性

3.3 体内副作用

3.4 rduIL-2蛋白,duIL-2 DNA载体的疫苗佐剂效应

4 讨论

第五章 duIL-2Rα cDNA克隆与生物信息学分析

1 材料

1.1 实验动物

1.2 菌种及质粒

1.3 工具酶及试剂

2 方法

2.1 引物设计

2.2 鸭脾细胞分离与培养

2.3 脾细胞总RNA的抽提

2.4 含通用标签的总cDNA第一链合成

2.5 引物探针梯度PCR（3'-RACE）

2.6 特异性小标签鉴定

2.7 序列测定拼接及生物信息学分析

3 结果

3.1 RT-PCR

3.2 测序结果

3.3 信号肽,成熟蛋白跨膜区,糖基化位点分析

3.4 鸭和其他动物IL-2Rα cDNA编码的氨基酸同源性及进化树分析

4 讨论

第六章重组鸭IL-2Rα原核表达与鉴定

1 材料

1.1 质粒、菌株和生化试剂

1.2 单克隆抗体和酶标抗体

1.3 常用缓冲液和培养基配制

2 方法

2.1 重组表达质粒的构建及序列测定

2.2 重组鸭IL-2Rα在pET32a表达系统中的表达与鉴定

3 结果

3.1 重组表达质粒pET32a-duIL2Rα的鉴定

3.2 最佳诱导时间的确定

3.3 Western blot鉴定

3.4 duIL-2Rα的纯化

4 讨论

第七章抗重组鸭IL-2Rα抗体的制备与鉴定

1 材料

1.1 实验动物、生化试剂及培养基

1.2 抗原和抗体

1.3 菌株、质粒、细胞系

2 方法

2.1 动物免疫

2.2 杂交瘤细胞株的建立、筛选及克隆化

2.3 Western blot

2.4 单克隆抗体Ig类别、亚类测定

2.5 多抗血清的制备

2.6 识别真核表达rduIL-2Rα蛋白的抗体筛选

2.7 腹水的制备及效价测定

2.8 识别内源性duIL-2Rα蛋白的抗体筛选

+细胞流式分析法建立'>2.9 CD25⁺细胞流式分析法建立

2.10 抗体抑制实验

3 结果

3.1 细胞株的筛选及克隆化

3.2 ELISA检测结果

3.3 Western blot检测及亚类鉴定

3.4 腹水制备及其效价

3.5 识别真核表位抗体筛选

3.6 识别内源性CD25抗原表位的抗体筛选

+细胞的建立'>3.7 流式法检测DuCD25⁺细胞的建立

3.8 抗体阻断实验

4 讨论

第八章禽流感病毒H9N2亚型感染鸭CD25表型细胞的动态分析

1.材料

1.1 病毒

1.2 动物

1.3 试剂

2.方法

2.1 动物感染

2.2 流式用脾细胞样品分离

2.3 CD25表型细胞的动态分析

3.结果

4 讨论

文献综述

第一章 IL-2研究综述

1 IL-2分子生物学研究

1.1 IL-2的发现及分子克隆

1.2 IL-2基因表达与调控

1.3 IL-2蛋白结构与突变体

2 内源性IL-2纯化

3 IL-2重组表达

3.1 原核表达

3.2 真核表达

4 抗IL-2抗体

5 IL-2的检测方法

5.1 ELISA与ELISPOT

5.2 IL-2活性检测法

6 IL-2效应细胞

6.1 IL-2对抗原激活T细胞的效应

6.2 IL-2对抗原激活B细胞的效应

6.3 IL-2对NK细胞的效应

7 IL-2转基因、基因敲除和疾病研究模型

8 IL-2药效动力学

9 IL-2的副作用

10 IL-2的应用

10.1 人IL-2蛋白的应用

10.2 动物IL-2基因免疫

11 禽IL-2研究进展

12 结论

第二章 IL-2受体alpha研究综述

1 IL-2Rα分子生物学

1.1 IL-2Rα的发现

1.2 IL-2Rα的分子克隆与基因结构

1.3 IL-2Rα基因的转录与诱导因子

1.4 IL-2Rα体外表达

1.5 IL-2Rα蛋白结构与功能分析

1.6 IL-2Rα转基因模型

2 Anti-TAC抗体

2.1 Anti-TAC的制备

2.2 Anti-TAC免疫学功能

2.3 Anti-TAC与βγ的发现

2.4 sIL-2Rα

2.5 anti-TAC与IL-2Rα发育生物学

3 IL-2Rα细胞亚群

4 IL-2Rα应用研究

4.1 抗体导弹（与其他如毒素偶连或者融合）

4.2 人源化IL-2Rα抗体

5 禽IL-2Rα研究进展

6 总结

全文结论及后续工作设想

参考文献（References）

附录常用缓冲液及培养基配方

致谢

攻读博士期间的科研成果

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