白蚁纤维素酶的分离纯化及性质研究

论文摘要

以厦门树白蚁（Glyptotermes Xiamenensis Li et Huang）为材料,经PBS缓冲液（pH 6.7）匀浆抽提处理、硫酸铵分级分离获得白蚁纤维素酶（Endo-1,4-β-D-Glucanase,EC 3.2.1.4,简称EGase）粗酶。进一步经DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换柱层析、Shephadex G-100凝胶过滤柱层析等纯化,得到比活力为458.7 U/mg的电泳单一纯的酶制剂,测定该酶的分子量约为44.8 kD,等电点（pI）为6.1,酶的紫外吸收峰在278 nm,荧光发射峰在334 nm。该酶水解羧甲基纤维素钠的最适pH值为5.0,最适温度40℃,米氏常数Km值为7.197 mg/ml,Vm为0.774 mmol/（L·min）（pH 5.0,40℃）。酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 4.6-9.0和在温度低于45℃下稳定。化学修饰剂:溴代乙酸（BrAc）、N-溴代丁二酰亚胺（NBS）、碳化二亚胺、醋酸酐、对氯汞苯甲酸（pCMB）、巯基乙醇（MT）、乙酰丙酮、过氧化氢（H2O2）、苯甲基磺酰氟（PMSF）,对酶修饰研究结果表明:咪唑基、吲哚基、羧基和氨基是该酶的活性功能基团,而蛋白质分子中巯基、二硫键、胍基、硫醚基和羟基与酶活力无关。溴代乙酸（BrAc）,NBS,醋酸酐的抑制机理表现为非竞争性类型抑制常数分别为42.8 mmol/L、83.1 mmol/L和16.5 mmol/L。金属离子对酶活力的影响:结果表明卤素阴离子（Cl-,Br-,I-）,碱金属离子（Li+,Na+,K+）对酶活力也没有影响。Ca2+,Zn2+,Mn2+对EGase具有明显的激活作用,重金属离子Cu2+,Pb2+,Hg2+对酶具有不可逆抑制作用。有机溶剂对酶活力的影响:甲醇、乙醇和丙醇这三种一元醇对酶均表现为抑制的作用,抑制强度依次是甲醇>丙醇>乙醇。乙二醇、丙二醇和丙三醇对酶也都具有强烈的抑制作用,其半抑制浓度(IC50)分别为3.8%、14.5%和16.2%。其中乙二醇的抑制作用是可逆过程,其抑制常数(K?)为3.8%。苯酚对厦门树白蚁EGase的半抑制浓度(IC50)为0.25 mol/L,其抑制机理表现为竞争性类型,苯酚和底物（S）竞争游离酶（E）的结合部位,但不能和结合酶（ES）结合。其抑制常数K?为0.64 mol/L。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
• 1.1 白蚁简介
• 1.1.1 形态特征
• 1.1.2 生活习性
• 1.1.3 白蚁肠道微生物
• 1.2 纤维素简介
• 1.2.1 纤维素分子结构与种类
• 1.2.2 纤维素的降解
• 1.3 纤维素酶简介
• 1.3.1 纤维素酶的研究历史
• 1.3.2 纤维素酶的来源
• 1.3.3 纤维素酶的组分及其分子结构
• 1.3.4 纤维素酶系统的作用机理
• 1.3.5 纤维素酶应用
• 1.4 本课题的研究意义及研究内容
• 第二章 实验材料、仪器与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 试剂处理
• 2.4 方法
• 2.4.1 蛋白质浓度的测定
• 2.4.2 酶活力和比活力的测定
• 2.4.3 酶的分离纯化
• 2.4.4 酶的纯度鉴定
• 2.4.5 酶的理化性质的测定
• 2.4.5.1 酶的分子量测定
• 2.4.5.2 酶分子的等电点测定
• 2.4.5.3 酶分子的亚基数及亚基分子量的测定
• 2.4.5.4 酶分子的紫外吸收光谱测定
• 2.4.5.5 酶分子的内源荧光光谱测定
• 2.4.6 酶催化反应的动力学性质研究
• 2.4.6.1 酶催化CMC-Na水解的动力学参数测定
• 2.4.6.2 酶催化CMC-Na水解反应的活化能测定
• 2.4.6.3 酶催化反应最适pH的测定
• 2.4.6.4 酶催化反应最适温度的测定
• 2.4.6.5 酶的pH稳定性测定
• 2.4.6.6 酶的热稳定性测定
• 2.4.7 效应物对酶的紫外吸收光谱的影响
• 2.4.8 效应物对酶的内源荧光光谱的影响
• 2.4.9 酶活性中心必需基团的研究响
• 2.4.9.1 酶的化学修饰
• 2.4.9.2 酶经NBS修饰后的光谱变化
• 2.4.9.3 修饰剂对酶活力影响及动力学研究
• 2.4.10 金属离子对酶活力的影响
• 2.4.11 有机污染物对酶活力的影响
• 第三章 实验结果
• 3.1 酶的分离、纯化及纯度鉴定
• 3.1.1 酶的分离纯化
• 3.1.2 酶制剂的纯度鉴定
• 3.2 酶分子的理化性质
• 3.2.1 酶的分子量测定
• 3.2.2 酶分子的亚基数及亚基的分子量测定
• 3.2.3 酶分子的紫外特征吸收光谱测定
• 3.2.4 酶的内源荧光特征
• 3.2.5 酶的等电点测定
• 3.3 该酶催化CMC-Na水解的动力学参数的测定
• 3.3.1 酶催化反应的动力学性质研究
• 3.3.2 酶催化CMC-Na水解反应的活化能测定
• 3.3.3 酶催化反应最适pH及pH稳定性测定
• 3.3.4 酶催化反应最适温度及温度稳定性的测定
• 3.4 酶活性必需基团的研究
• 3.4.1 MT对酶的化学修饰
• 3.4.2 组氨酸咪唑基的化学修饰
• 3.4.3 pCMB对酶的化学修饰
• 3.4.4 酶活性中心色氨酸残基的化学修饰
• 3.4.5 酶经NBS修饰后的光谱变化
• 3.4.6 羧基的化学修饰
• 3.4.7 氨基的化学修饰
• 3.4.8 精氨酸残基的化学修饰
• 3.4.9 甲硫氨酸残基的化学修饰
• 3.4.10 丝氨酸羟基与酶活力的关系
• 3.5 修饰剂对酶的效应动力学
• 3.5.1 溴乙酸对酶活力影响及动力学研究
• 3.5.1.1 溴乙酸对酶活力的影响
• 3.5.1.2 溴乙酸对酶的抑制类型及抑制常数
• 3.5.2 NBS对酶活力影响及动力学研究
• 3.5.2.1 NBS对酶活力的影响
• 3.5.2.2 NBS对酶的抑制类型及抑制常数
• 3.5.3 醋酸酐对酶活力影响及动力学研究
• 3.5.3.1 醋酸酐对酶活力的影响
• 3.5.3.2 醋酸酐对酶的抑制类型及抑制常数
• 3.6 几种离子对厦门树白蚁EGase活力的影响
• 3.6.1 卤素阴离子对厦门树白蚁EGase活力的影响
• 3.6.2 几种金属离子对厦门树白蚁EGase活力的影响
• 3.6.2.1 碱金属离子对厦门树蚁EGase活力的影响
• 2+和Ca²⁺对EGase活力的影响'>3.6.2.2 正二价碱土金属离子Mg²⁺和Ca²⁺对EGase活力的影响
• 3.6.2.3 过渡金属离子对厦门树白蚁EGase活力的影响
• 3.6.3 几种金属离子对厦门树白蚁EGase的抑制作用类型
• 2+对厦门树白蚁EGase活力的影响及抑制作用类型'>3.6.3.1 Cu²⁺对厦门树白蚁EGase活力的影响及抑制作用类型
• 2+对厦门树白蚁EGase活力的影响及抑制作用类型'>3.6.3.2 pb²⁺对厦门树白蚁EGase活力的影响及抑制作用类型
• 2+对厦门树白蚁EGase活力的影响及抑制作用类型'>3.6.3.3 Hg²⁺对厦门树白蚁EGase活力的影响及抑制作用类型
• 3.7 种有机溶剂对酶活力影响及动力学研究
• 3.7.1 对酶活力影响及动力学研究
• 3.7.2 丙酮对EGase活力的影响
• 3.7.3 苯酚对EGase活力的影响
• 3.7.4 二甲亚砜对EGase活力的影响
• 3.7.5 二氧六环对EGase活力的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 厦门树白蚁（EGase）的分离纯化与部分性质的研究
• 4.2 厦门树白蚁EGase酶学性质和动力学性质
• 4.3 厦门树白蚁EGase的紫外特征光谱及内源荧光特征
• 4.4 厦门树白蚁EGase的化学修饰
• 4.5 修饰剂对EGase的抑制动力学研究
• 4.6 效应物对EGase活力的影
• 结论
• 参考文献
• 致谢