H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染仔猪肺组织的基因表达谱分析

论文摘要

猪流感病毒（SIV）与猪链球菌2型（SS2）均为重要的呼吸道病原,两者混合感染所引起的猪呼吸道疾病综合征（PRDC）在临床中普遍存在,给养猪业造成了严重的经济损失。迄今为止,这两种病原的致病机制以及混合感染的协同致病机制仍不清楚,尚无有效的防治措施。本研究以仔猪为实验动物构建H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染模型,利用基因芯片揭示单独感染与混合感染后仔猪肺组织的基因表达谱,并对差异表达基因进行分析,旨在探讨单独感染与混合感染在致病机制上的异同,为疫情的防制进行有益探索。1.仔猪H1N1猪流感病毒-猪链球菌2型混合感染模型建立在人工感染试验中,12头经检测SIV病原与抗体阴性、SS2抗体阴性仔猪随机分为4组,每组3头。实验第1天,SIV组和SIV-SS2组的仔猪鼻腔接种H1N1病毒液,同时空白对照组和SS2组使用DMEM进行相同处理。实验第4天,各组仔猪经2%冰醋酸溶液滴鼻处理30分钟后,SS2组和SIUSS2组的仔猪鼻腔接种SS2细菌液,同时空白对照组和SIV组使用PBS进行相同处理。实验第6天,解剖各组仔猪观察脏器病变、采集样品（提取总RNA、分离鉴定病原、制作病理切片）。自实验开始,每天监测仔猪的体温、临床表现,隔天采集鼻拭子。研究结果显示：相对于单独感染,H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染可引起更严重的体温紊乱、更多样的临床症状,范围更广、程度更深的剖检病变和组织病变；同时猪链球菌2型可能有助于H1N1猪流感病毒的增殖,使猪流感的感染症状持续更长的时间。2.仔猪H1N1猪流感病毒-猪链球菌2型混合感染基因表达谱分析利用从上述模型构建中采集的各组肺脏样品,抽提总RNA,经纯化、反转录、标记后与Agilent4x44K Porcine Oligo Microarray杂交。芯片原始数据经扣本底和归一化处理后,采用一维方差分析法（one way ANOVA）对组间差异进行统计学分析,以组间差异倍数（Fc）≥1.5,且q-value<0.05为标准筛选差异表达探针。结果显示：SIV组、SS2组、SIV-SS2组分别有1314、1354、2652个差异表达探针,对应444、411、844个差异表达基因。以Biological process为分类依据对各组差异表达基因进行Gene Ontology分析,结果显示SIV组、SS2组、SIV-SS2组的差异表达基因主要参与信号转导（signal transduction）.转录（transcription）.发育（development）.免疫应答（immune response）.细胞粘附（cell adhesion）.炎性反应（inflammatory response）.凋亡（apoptosis）.天然免疫应答（innate immune response）等生物过程。以Kegg为数据库对各组差异表达基因进行pathway分析,结果显示SIV组、SS2组、SIV-SS2组的差异表达基因主要涉及细胞因子与细胞因子受体互作（Cytokine-cytokine receptor interaction）.Toll样受体途径（Toll-like receptor signalingpathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、凋亡（Apoptosis）、补体途径（Complement and coagulation cascades）、细胞粘附分子（Cell adhesion molecules）、天然杀伤细胞介导的细胞毒作用（Natural killer cell mediated cytotoxicity）、造血（Hematopoietic cell lineage）等信号通路。通过对比、分析SIV组、SS2组、SIV-SS2组的基因表达谱,推测H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染的致病机制至少包括以下两点：（1）混合感染可刺激宿主产生大量细胞因子,造成炎性细胞浸润,引起炎性病理损伤；（2）混合感染可诱导宿主细胞大量凋亡,引起肺脏机能障碍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）
• 1.2 猪链球菌2型
• 1.3 H1N1型猪流感
• 1.4 基因芯片
• 1.5 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 毒株与菌种
• 2.2 实验动物
• 2.3 基因芯片
• 2.4 主要试剂及仪器
• 2.5 H1N1猪流感病毒检测
• 2.6 H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型抗体检测
• 2.7 人工感染试验病原的制备
• 2.8 仔猪人工感染
• 2.9 样品采集
• 2.10 样品总RNA提取
• 2.11 芯片杂交
• 2.12 荧光定量PCR（qRT-PCR）
• 2.13 病理观察及细胞凋亡TUNEL检测
• 2.14 统计学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型血清学调查
• 3.2 感染前后相关病原与抗体的检测
• 3.3 临床症状
• 3.4 剖检与病理变化
• 3.5 总RNA质量检测
• 3.6 芯片质检
• 3.7 差异表达基因的筛选
• 3.8 差异表达基因的分析
• 3.9 荧光定量PCR验证
• 3.10 细胞凋亡检测
• 4 讨论
• 4.1 混合感染的病原检测
• 4.2 临床症状与病理变化
• 4.3 SIV组差异表达基因
• 4.4 SS2组差异表达基因
• 4.5 SIV-SS2组差异表达基因
• 5 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢