海洋养殖水体抗药性细菌种类及其抗药性基因携带情况的研究

论文摘要

水产养殖过程中抗生素药物的高剂量及多种药物混合使用等滥用现象,往往使水产病原菌在高的选择压力下产生更强的耐药性,多重药物抗性细菌也时有发生,大大增加了微生物病害防治的难度,给水产养殖业带来严重危害。为探讨抗性细菌的抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础,本研究以由大连刺参、中球海胆、皱纹盘鲍与大菱鲆这四种水体所分离的多抗性细菌筛选为基础,利用分子生物学方法对这些抗性细菌进行了土霉素、氯霉素及氟氯霉素抗性基因的筛选。通过对分离自这四个养殖水体中的抗性细菌16S rRNA基因序列分析和系统进化树的构建,这些抗性细菌大部分属于海洋弧菌(Vibrio) ,少数几株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)或交替单胞菌(Alteromonas)。弧菌类菌株中大部分为塔斯马尼亚弧菌(Vibrio tasmaniensis)或灿烂弧菌(Vibrio splendidus)。我们采用多重PCR方法分析这些抗性细菌中四环素抗性基因(tet基因)、氯霉素抗性基因(cat基因)与氟氯霉素(flo基因)的分布特征。在对80株抗性细菌tet基因的分析中,共有tet(A)、tet(B)、tet(D)、tet(E)、tet(M)五种基因单倍型被检测到,其中tet(B)、tet(D)、tet(M)三种基因的携带率最高,分别为33.8%、42.5%、41.3%。对80株抗性细菌cat与flo基因的分析中,共有cat II与cat IV两种cat基因基因单倍型被检测到,它们的检出率分别为37.5%、18.8%;共36株菌株携带floR基因,检出率为45.0%。研究发现,大部分耐药细菌都携带多种抗性基因,证明它们的耐药性主要是由相应抗性基因决定的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 海洋养殖水体微生物病害及治理现状
• 1.2 基于16S rRNA 基因序列分析的细菌分类学研究
• 1.3 细菌耐药性的产生与作用机理
• 1.3.1 遗传学机制
• 1.3.1.1 染色体介导的耐药
• 1.3.1.2 质粒介导的耐药
• 1.3.1.3 转座子介导的耐药性
• 1.3.1.4 整合子与基因盒介导的耐药性
• 1.3.1.5 转导
• 1.3.2 生物化学机制
• 1.3.2.1 产生灭活酶或钝化酶
• 1.3.2.2 对抗菌药物的渗透障碍
• 1.3.2.3 药物主动外输机制引起的耐药性
• 1.3.2.4 作用靶位的改变
• 1.3.2.5 细菌产生抗菌药物的拮抗物
• 1.3.2.6 生物膜的形成
• 1.3.2.7 对药物代谢的失败引起的耐药性
• 1.3.2.8 细菌代谢途径或代谢状态的改变
• 1.4 抗菌药物种类
• 1.5 海水细菌耐药性的研究
• 1.5.1 四环素抗性细菌及其抗性基因的研究
• 1.5.2 氯霉素抗性细菌及其抗性基因的研究
• 1.6 本研究的目的和拟解决的科学问题
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 实验所需试剂及培养基配方
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品采集与处理
• 2.2.2 细菌计数
• 2.2.2.1 水样中总细菌计数
• 2.2.2.2 水样中可培养细菌计数
• 2.2.2.3 水样中可培养具土霉素抗性的细菌计数
• 2.2.3 土霉素抗性细菌的多抗性筛选
• 2.2.4 土霉素抗性细菌的培养及基因组DNA 提取
• 2.2.5 土霉素抗性细菌16S rRNA 基因的扩增与序列分析
• 2.2.6 常见土霉素抗性基因的筛选
• 2.2.7 氯霉素与氟氯霉素两类抗性基因的筛选
• 2.2.8 核酸序列的提交、序列号
• 3. 结果与讨论
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 细菌计数
• 3.1.1.1 水样中总细菌计数
• 3.1.1.2 水样中可培养细菌计数
• 3.1.1.3 水样中可培养具土霉素抗性的细菌计数
• 3.1.2 土霉素抗性细菌的多抗性筛选
• 3.1.3 土霉素抗性细菌的16S rRNA 基因的扩增与序列分析
• 3.1.4 tet 基因的筛选
• 3.1.5 cat 与floR 基因的筛选
• 3.2 讨论
• 3.2.1 海洋养殖环境的主要抗性细菌类群-海洋弧菌
• 3.2.2 tet 基因的多样性及分布情况
• 3.2.3 cat 与floR 基因的多样性及分布情况
• 参考文献
• 附表1 抗性菌株所携带的部分抗性基因情况
• 致谢
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文与研究成果