RGD-重组蛛丝蛋白作为新型生物敷料的研究

论文摘要

蜘蛛丝是一类具有优越力学性能如具有高度的张力和弹力的天然生物材料,同时天然蜘蛛丝具有良好的生物相容性,在生物医学领域有着广阔的应用领域。本文对RGD-重组蛛丝蛋白工程菌pNS16/BL21（DE3）pLysS和pNS32/BL21（DE3）pLysS的高密度发酵工艺进行优化,进行重组蛛丝蛋白纯化,所获得的重组蛛丝蛋白用于制备重组蛛丝蛋白膜材料,SD大鼠体内植入实验验证了其生物相容性,并首次尝试将该材料作为一种新型的生物敷料运用于SD大鼠深Ⅱ度皮肤烫伤修复。首先研究了诱导前菌体密度,诱导时添加Gly/Ala浓度,诱导后菌体培养温度三个因素对RGD-重组蛛丝蛋白工程菌高密度发酵目的蛋白表达的影响。通过优化实验与重复实验,确立pNSR16/BL21（DE3）pLysS获得较高表达水平的综合条件为:诱导时菌体OD600nm=30,温度30℃,0.2%（w/v）的Gly/Ala浓度;pNSR32/BL21（DE3）pLysS工程菌为:诱导时菌体OD600nm=30,温度30℃,0.4%（w/v）的Gly/Ala浓度。对RGD-重组蛛丝蛋白工程菌进行大规模目的蛋白纯化,以获得用于组织工程研究的基础原材料（pNSR16和pNSR32重组蛛丝蛋白）。按本室建立的膜制备方法,选用不含RGD（Arg-Gly-Asp）位点的pNS2和含有RGD位点的pNSR16蛛丝蛋白以及聚乙烯醇（PVA）制备膜材料,并将其用于大鼠体内植入实验,比较了它们的组织相容性的异同;其中,设定pNS2和pNSR16支架材料为实验组,PVA支架材料作为阳性对照,以空白组作为阴性对照进行实验,观察在不同的时期的体内植入情况。实验结果根据国家标准GB/T16886-6植入后局部反应试验证明pNS2和pNSR16支架材料均能在一定程度上抑制炎症细胞生长,显示出良好的组织相容性,其中以pNSR16支架材料最佳。在此基础上,将都含有RGD位点但分子量不同的重组蛛丝蛋白pNSR16、pNSR32以及胶原蛋白作为三种生物敷料应用于SD大鼠的深Ⅱ度皮肤烫伤修复实验。大鼠烫伤模型通过采用直径2.0cm的砝码（50g）沸水煮15min,压于大鼠背部脱毛区持续15s来建立,组织学检测该模型符合深Ⅱ度烫伤病理学特征。以pNSR16、pNSR32蛛丝蛋白膜材料为实验组,胶原蛋白膜材料为阳性对照,空白组为阴性对照,对烫伤模型进行皮肤修复。实验发现烫伤创面外敷pNSR16蛛丝蛋白和pNSR32蛛丝蛋白均可以缩短创面愈合时间,提高创面愈合率,增加创面羟脯氨酸含量水平,并且bFGF因子的表达水平均高于阳性和阴性对照组。实验结果表明pNSR32蛛丝蛋白对于烫伤皮肤的修复效果最好,其次是pNSR16蛛丝蛋白;在本实验中,胶原蛋白膜材料的皮肤修复效果不如基因重组蛛丝蛋白材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 蜘蛛丝蛋白
• 1.1.1 天然蜘蛛丝优越性能
• 1.1.2 蜘蛛丝蛋白的应用前景
• 1.1.3 人工蛛丝蛋白的研究
• 1.2 人工蛛丝蛋白的原核表达及其高密度发酵工艺概况
• 1.2.1 原核表达系统及其发酵
• 1.2.2 大肠杆菌高发酵的相关影响因素
• 1.3 人工蛛丝蛋白的真核表达
• 1.4 组织工程多孔支架材料
• 1.4.1 多孔性支架材料的制备技术
• 1.4.2 组织工程支架材料的生物相容性的研究。
• 1.5 人工生物敷料皮肤创面修复的应用
• 1.5.1 生物敷料的种类
• 1.5.2 生物敷料的发展趋势及市场潜力
• 1.5.3 生物敷料的优点及作用机理
• 1.6 组织工程皮肤在皮肤创面修复中的应用
• 1.6.1 表皮替代物
• 1.6.2 真皮替代物
• 1.6.3 人工复合皮肤
• 1.7 皮肤创伤愈合的生物学机制
• 1.7.1 成纤维细胞在创伤愈合中的作用
• 1.7.2 生长因子在创伤愈合过程中的作用
• 1.7.3 皮肤创面修复结果的评价标准
• 1.8 生物敷料和组织工程皮肤展望
• 1.9 本研究的背景、主要内容及意义
• 1.9.1 本研究的背景材料
• 1.9.2 本研究的主要内容
• 1.9.3 本研究的意义
• 第2章 RGD-重组蛛丝蛋白高密度发酵工艺优化与纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和重组质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 培养基与主要试剂
• 2.2 方法
• 21（DE₃）pLysS工程菌的重新转化'>2.2.1 pNSR16/BL₂₁（DE₃）pLysS工程菌的重新转化
• 2.2.2 蛛丝蛋白基因工程菌的高密度发酵
• 2.2.3 发酵过程评价
• 2.2.4 蛛丝蛋白基因工程菌目的蛋白的纯化
• 2.3 结果
• 21（DE₃）pLysS工程菌的鉴定'>2.3.1 新转化pNSR16/BL₂₁（DE₃）pLysS工程菌的鉴定
• 21（DE₃）pLysS工程菌的筛选'>2.3.2 pNSR16/BL₂₁（DE₃）pLysS工程菌的筛选
• 2.3.3 摇瓶培养诱导前菌体浓度对蛋白表达的影响
• 21（DE₃）pLysS工程菌分批补料高密度发酵'>2.3.4 pNSR16/BL₂₁（DE₃）pLysS工程菌分批补料高密度发酵
• 21（DE₃）pLysS工程菌分批补料高密度发酵'>2.3.5 pNSR32/BL₂₁（DE₃）pLysS工程菌分批补料高密度发酵
• 2.3.6 所建立发酵工艺的重复实验
• 2.3.7 考马斯亮蓝标准曲线的绘制
• 2.3.8 pNSR16蛋白的纯化
• 2.3.9 pNSR32蛋白的纯化
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第3章 重组蛛丝蛋白膜材料的组织相容性研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要材料
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要仪器和器械
• 3.1.4 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 支架制备
• 3.2.2 植入前支架处理
• 3.2.3 创伤模型
• 3.2.4 组织学石蜡切片步骤
• 3.2.5 组织学石蜡染色
• 3.2.6 组织学评价
• 3.3 pNS2、pNSR16支架材料的组织相容性评价
• 3.3.1 支架材料形态观察
• 3.3.2 术后大体观察
• 3.3.3 植入材料HE染色结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第4章 重组蛛丝蛋白作为新型生物敷料在皮肤烫伤修复的应用
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要材料
• 4.1.2 实验动物饲养
• 4.1.3 主要仪器和器械
• 4.1.4 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 pNSR32和pNSR16蛛丝蛋白敷料制备
• 4.2.2 实验材料的预处理
• 4.2.3 SD大鼠烫伤模型的建立
• 4.2.4 手术流程
• 4.2.5 实验分组
• 4.2.6 烫伤修复的评价标准
• 4.2.7 石蜡切片步骤
• 4.2.8 组织学切片染色
• 4.2.9 羟脯氨酸含量测定
• 4.2.10 bFGF免疫组化检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 SD大鼠烫伤模型
• 4.3.2 蛛丝蛋白敷料和胶原敷料的获得
• 4.3.3 术后大体观察
• 4.3.4 创面愈合率计算
• 4.3.5 皮肤修复的HE染色结果
• 4.3.6 羟脯氨酸含量测定数据分析
• 4.3.7 bFGF-2免疫组化检测
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历