人血清白蛋白/人白介素-2融合蛋白的表达与发酵

论文摘要

白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）是分子量为15 kDa的糖蛋白,在体内由T细胞产生,通过促进T细胞的增值,增强人体的免疫能力。为提高IL-2在体内的半衰期,实验室构建了携带有IL2-HSA融合蛋白编码基因的质粒pPIH,并在Pichia pastoris KM71中表达。本研究在此基础上,通过三种溶氧控制策略和甲醇诱导条件的改变,试图在5L罐中,探索提高产物表达量的最优条件,结果证明已构建的P. pastoris KM71/pPIH,产物的最大表达量为44 mg/L,该菌株生产潜力小。构建了3株不同宿主的IL2-HSA表达菌,P. pastoris GS115/pPIH、P. pastoris KM71/pPIH、P. pastoris SMD1168/pPIH。对其诱导条件优化后,在各自的最优表达条件下进行比较发现,GS115最适合表达IL2-HSA融合蛋白,其摇瓶表达量为314 mg/L,分别是KM71,SMD1168表达量的2.7倍和2.9倍。对三株菌的发酵上清进行Western Blot验证,结果显示,81 kDa处的条带可以与HSA和IL2两种抗体都发生免疫反应,且分子量与理论计算相符,认为是完整的IL2-HSA蛋白。发酵清液经脱盐、冻干保存,取干粉复溶后,用CTLL-2/MTT法测得粗蛋白的IL-2生物学活性为1.05×106 IU/mg。最后根据密码子的偏爱性以及IL-2的结构特性,本研究对天然IL2编码序列进行了优化,用高频密码子替换其中低频密码子,并将第125位游离Cys点突变为Ala。构建了融合蛋白HSA-IL2m的表达菌P. pastoris GS115/pPHIm,对其诱导条件进行初步优化,其摇瓶产量为144 mg/L。发酵清液经脱盐、冻干保存,取干粉复溶后测得粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×106 IU/mg。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 人白介素-2 概况
• 1.1.1 人白介素-2
• 1.1.2 IL-2 的生物学作用及临床应用
• 1.1.3 长效IL-2 的研究进展
• 1.2 人血清白蛋白（HSA）概况
• 1.2.1 人血清白蛋白简介
• 1.2.2 人血清白蛋白的表达系统研究进展
• 1.2.3 白蛋白融合技术（Albumin fusion technology）
• 1.3 毕赤酵母（PICHIA PASTORIS）表达系统
• 1.3.1 几种毕赤酵母宿主的特性
• 1.3.2 毕赤酵母表达载体
• 1.3.3 影响外源基因在毕赤酵母中高效表达的因素
• 1.4 研究背景与内容
• 第二章 5L 发酵罐上溶氧和甲醇浓度对IL2-HSA 表达量的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试菌种
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 5L 罐中菌体生长阶段发酵过程分析
• 2.3.2 诱导阶段溶氧对融合蛋白表达量的影响
• 2.3.3 诱导阶段甲醇浓度对融合蛋白表达量的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 IL2-HSA 在毕赤酵母三种宿主中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组毕赤酵母的构建
• 3.3.2 高表达转化子的筛选
• 3.3.3 一级种子菌龄的确定
• 3.3.4 诱导条件对融合蛋白表达量的影响
• 3.3.5 表达产物Western Blot 分析
• 3.3.6 表达产物的活性测定
• 3.4 本章小节
• 第四章 人血清白蛋白/人白介素-2 C125A 突变体在毕赤酵母中表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 IL2m 基因的设计
• 4.3.2 融合蛋白表达基因的构建
• 4.3.3 表达载体pPHIm 的构建
• 4.3.4 阳性转化子的筛选及诱导产物的Western blot 鉴定
• 4.3.5 表达产物的活性测定
• 4.3.6 诱导条件对HSA-IL2m 表达量的影响
• 4.3.7 初步优化的诱导条件下目的蛋白的表达
• 4.3.8 融合蛋白HSA-IL2m 降解条带的分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 主要结论
• 5.1 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文