副溶血弧菌常规调查及其3种基因（tlh、tdh及trh）LAMP检测方法的研究

论文摘要

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种重要的食源性致病菌,人们食用受该菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐等症状,甚至导致脱水、休克及死亡。目前,副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模呈明显扩大趋势,已成为我国首要的食源性致病菌。因此,对副溶血弧菌进行常规调查,了解其分布、形态和类型以及发展新型副溶血弧菌检测方法就显得尤为重要。当前,虽然国内外已有采用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测副溶血性弧菌的相关报道,但是仍存在成本高、耗时长、不稳定和易污染等不足,因此迫切需要一种新型的检测副溶血弧菌的方法。目的:了解市售水产品中副溶血弧菌污染情况并建立简便、快速和灵敏的新型LAMP检测副溶血弧菌基因tlh、tdh和trh的方法。方法:一、在食物中毒高发季节采集鱼、虾、贝、蟹及头足5类20种共161份样本,然后按照传统培养法和生理生化法进行副溶血弧菌分离和鉴定,之后采用普通PCR法检测副溶血弧菌的tlh基因进行验证,并对其毒力基因（tdh和trh）进行检测和分布统计分析,最后采用11种O群分群血清对分离到并验证的副溶血弧菌进行血清分群研究。二、针对副溶血弧菌种特异性基因-不耐热溶血毒素基因（tlh）的6个特异性位点设计1套LAMP引物,通过对反应体系（镁离子浓度、甜菜碱浓度、内外引物比及环引物加入与否）及反应条件（反应温度和反应时间）的优化建立副溶血弧菌的LAMP检测法,之后通过采用LAMP法检测74株实验菌评价其特异性,通过采用LAMP法检测梯度稀释的标准菌基因组DNA、纯培养的副溶血弧菌及贝类模拟样本评价其检测敏感性,并与普通PCR法检测敏感性对比分析评价其应用价值。三、针对副溶血弧菌种特异性基因-溶血毒素基因（tdh及trh）的6个特异性位点分别设计1套LAMP引物,采用新建的LAMP法体系和条件对74株食源性病原菌分别进行tdh和tlh基因的LAMP检测,观察其检测特异性并评价该方法的现场应用价值。结果:一、通过传统方法分离和鉴定及PCR验证,161份样本中共检出副溶血弧菌45株,平均检出率为27.95%,不同种类水产品中V p的检出率有显著性差异（χ2= 11.20, 0.01<p<0.05）,其中含tdh基因的有7株、含trh基因的0株;45株副溶血弧菌共分出7个血清型,分别为O:1群占2.2%（1/45）,O:3群占24.4%（11/45）、O:4群占15.6%（7/45）、O:5群占20.0%（9/45）、O:9群占4.4% （2/45）、O:10群占8.9%（4/45）、O:11群占26.7%（12/45）。二、反应体系和条件的优化表明,tlh基因的LAMP检测在8 mM镁离子、0M甜菜碱、8:1的内外引物比、加入40mM环引物的反应体系,60℃反应55分钟即可完成;该方法检测74株实验菌中副溶血弧菌均阳性,其它菌和空白对照都阴性;该方法检测标准菌基因组DNA最低检测限可达到1fg,检测纯培养物最低检测限为2.53×102CFU/mL（较普通PCR高1000倍）,检测贝类模拟样本最低检测限为9.42×102CFU/g（较普通PCR高1000倍）。三、tdh的LAMP检测法检测74株食源性病原菌中,7株含tdh基因的副溶血弧菌均为阳性,其余均为阴性;trh基因的LAMP检测法检测74株食源性病原菌中,1株含trh基因的副溶血弧菌为阳性,其余均为阴性。结论:本研究副溶血弧菌常规调查对上海市市售水产品中副溶血弧菌的分布情况提供了部分参考依据,同时本研究建立的以tlh、tdh和trh基因为基础的LAMP检测法简便、快速、高灵敏度和高特异性,进一步优化、完善和推广后有望应用于现场水产品中副溶血弧菌的监测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 引物设计
• 1.2 反应体系及条件
• 1.3 扩增结果
• 1.4 LAMP 技术的优点:
• 1.5 LAMP 技术的缺点
• 1.6 实时LAMP 监测的基本原理
• 1.7 实时LAMP 的优点
• 1.8 实时LAMP 的缺点
• 1.9 LAMP 方法在检测常见食源性致病菌的应用
• 1.9.1大肠杆菌 O157 检测
• 1.9.2 志贺氏杆菌检测
• 1.9.3 副溶血弧菌检测
• 1.9.4 沙门氏菌检测
• 1.10 LAMP 技术的展望
• 第二章 水产品中副溶血性弧菌的分离、鉴定及毒力基因和血清型分布研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 传统分离方法结果
• 2.2.2 副溶血性弧菌tlh 基因的检测结果
• 2.2.3 副溶血性弧菌毒力基因tdh 和trh 的检测结果
• 2.2.4 副溶血性弧菌血清型分析结果
• 2.2.5 副溶血性弧菌检出报告
• 2.3 讨论
• 第三章 新型LAMP 检测副溶血弧菌法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 2+浓度'>3.2.1 最适Mg²⁺浓度
• 3.2.2 最适甜菜碱浓度
• 3.2.3 内外引物浓度比
• 3.2.4 环引物加入与不加入
• 3.2.5 反应温度
• 3.2.6 反应时间
• 3.2.7 特异性试验
• 3.2.8 颜色反应结果
• 3.2.9 基因组DNA 检测灵敏度
• 3.2.10 纯培养物检测灵敏度
• 3.2.11 对贝类样品检测灵敏度
• 3.2.12 普通PCR 法检测副溶血弧菌
• 3.3 讨论
• 第四章 新型LAMP 法检测副溶血性弧菌tdh 及trh 基因的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 副溶血弧菌标准菌株tdh 基因LAMP 检测结果
• 4.2.2 tdh 基因LAMP 检测特异性结果
• 4.2.3 副溶血弧菌标准菌株trh 基因LAMP 检测结果
• 4.2.4 trh 基因LAMP 检测特异性结果
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢