农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶基因的遗传转化研究

论文摘要

根据已报道的甘蔗ACO基因的序列,在读码框外设计特异引物,通过RT-PCR技术,克隆了甘蔗ACO基因编码区969bp的cDNA片段,分别正向和反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建了ACO基因的正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,该载体的抗性选择标记为NPTⅡ基因。利用冻融法分别将正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco导入根癌农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法,将ACO正、反义基因导入烟草K346。经PCR筛选,获得34株正义和28株反义转基因植株,转化率分别为24%和31%。取部分PCR阳性植株进行Dot-Southern杂交检测,证明外源基因已整合入烟草的基因组中。采用气相色谱法对转基因烟草进行内源乙烯释放量测定,结果显示,正义转基因烟草的乙烯释放比对照平均增加77.22%,面反义转基因烟草的乙烯释放量仅为对照的31.67%,达到极显著差异。说明甘蔗ACO正、反义基因可在异源真核系统中实现功能性表达。转基因烟草移栽后,反义转基因烟草表现出前期生长延缓、后期开花延迟特性,正义转基因烟草表现出前期生长快、后期开花早特性。通过农杆菌介导法将ACO反义基因遗传转化甘蔗ROC22,经过G418抗性筛选,获得19株抗性植株。对选择标记NPTⅡ基因进行PCR检测,有2株呈现阳性,该阳性转基因植株生长状况较野生型和PCR阴性的植株差,生长迟缓,矮化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 ACC氧化酶与乙烯的生物合成
• 1.1.1 乙烯的生物合成途径
• 1.1.2 植物ACO基因及其分子生物学研究
• 1.2 乙烯对甘蔗生长发育的调控
• 1.2.1 乙烯利在甘蔗生产上的应用
• 1.2.2 乙烯对甘蔗生长发育的生理生化研究
• 1.3 甘蔗转基因技术
• 1.3.1 实现甘蔗遗传转化的方法
• 1.3.2 甘蔗遗传转化的国内外研究现状
• 1.3.3 影响遗传转化成功与否的因素
• 1.4 本研究的目的意义及内容
• 2 甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒与菌种
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 甘蔗ACO基因编码区cDNA序列的克隆
• 2.2.2 甘蔗ACC氧化酶正、反义基因植物表达载体的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA的完整性
• 2.3.2 PCR产物的鉴定
• 2.3.3 甘蔗ACO cDNA的序列比较
• 2.3.4 甘蔗ACC氧化酶cDNA植物表达载体的鉴定和分析
• 2.4 讨论
• 3 农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶正、反义基因遗传转化烟草研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 根癌农杆菌的转化与鉴定
• 3.2.2 烟草叶片组织对卡那霉素的敏感性
• 3.2.3 转基因烟草植株的获得及其性状表现
• 3.2.4 农杆菌介导烟草转化效率
• 3.2.5 转基因植株的PCR鉴定
• 3.2.6 转基因植株的Dot-Southern检测
• 3.2.7 转正、反义甘蔗ACO基因烟草叶片乙烯释放量的测定
• 3.3 讨论
• 4 农杆菌介导ACC氧化酶反义基因遗传转化甘蔗初步研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 甘蔗胚性愈伤组织的诱导
• 4.2.2 甘蔗对G418的敏感性
• 4.2.3 农杆菌介导法转化甘蔗的结果
• 4.2.4 抗性植株的PCR检测
• 4.3 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 研究总结
• 5.2 后续研究
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B