论文摘要
淋巴样增强因子-1（LEF-1）,位于人4号染色体q23-q25区域,是淋巴增强因子/T-细胞因子（LEF/TCF）家族的成员之一,属于高迁移率组分（high mobility group,HMG）,并作为一个重要的转录因子是Wnt信号通路的核心成分。其氨基端与β-连环蛋白结合形成β-连环蛋白/LEF复合物,从而活化基因转录,β-连环蛋白/LEF复合物也被认为Wnt途径的“活化枢纽”,与细胞分化及肿瘤发生关系密切。研究表明TCF家族其他成员均具有多种不同形式异构体,并且其羧基端可形成选择性功能域,对抑制或活化选择性的Wnt靶基因起着必需的作用。本研究拟通过生物信息学方法分析LEF-1羧基端是否可能形成新的异构体;并针对LEF-1异构体制备特异性的单克隆抗体,明确其表位;再对LEF-1异构体从蛋白表达等方面进行初步研究,为进一步完善对LEF-1结构与功能的认识奠定基础。研究目的:探讨LEF-1是否存在分子结构有差异的异构体;利用生物信息学分析该LEF-1异构体产生的原因和可能的功能改变;针对LEF-1异构体制备特异性单克隆抗体并明确其表位;在细胞株及部分组织标本中检测该异构体的表达情况。主要研究内容和结果:1.LEF-1的生物信息学分析（1）根据GenBank中LEF-1序列,发现Human LEF-1以UGA作为终止码。然而UGA在某些组织中却可以编码一种氨基酸——硒代半胱氨酸（Sec）,这种现象也称为通读。Sec又被人称为第21种氨基酸。这一过程与翻译过程同时进行。在真核生物中Sec的编码机制是十分复杂的,将Sec插入蛋白质必需有硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）的参与。SECIS通常位于硒蛋白的mRNA的3’-UTR,并形成一个茎环结构。利用RNA structure软件,我们对human LEF-1的mRNA 3’UTR进行分析,其存在有一个茎环结构。（2）对可能的LEF-1异构体通读段（eLEF-1）蛋白质进行ClustalW软件比对,表明LEF-1异构体通读段与HMG家族蛋白质氨基酸一致性达30.7%,相似性49.3%。进一步通过基于HMG家族蛋白质的同源建模,表现了eLEF-1与DNA之间的相互作用,并且eLEF-1蛋白结构与HMG家族蛋白质有着高度的结构相似性。同时分子动力学刺激表明DNA与eLEF-1模型复合物的稳定时间超过1ns。以上均提示新的LEF-1异构体可能具有一个新的HMG结构域,并通过该结构域与DNA结合,有可能具有新的功能。2.抗eLEF-1单克隆抗体的制备Jurkat细胞mRNA逆转录所得cDNA为模板,克隆eLEF-1于原核表达载体PQE40中,经测序验证后IPTG诱导表达。eLEF-1-PQE40以包涵体形式表达,经尿素变性后,利用离子交换层析、亲和层析纯化,透析复性后得到免疫原eLEF-1-PQE40融合蛋白,免疫Balb/c小鼠。经过两次细胞融合、单克隆抗体的筛选、克隆化、共得到可以稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系6株。其中1株阳性克隆命名为: B8,经亚类检测为IgG1型。用其制备的腹水经过ProteinA柱得到纯化的单克隆抗体。同时构建eLEF-1-pET32a原核表达载体,利用eLEF-1-pET32a融合蛋白鉴定B8特异性。B8为特异性抗eLEF-1的单克隆抗体。3.单克隆抗体B8表位鉴定:eLEF-1不同长度的基因片段定向克隆入PQE40,各片段诱导表达后,利用免疫印迹初步鉴定B8的表位位于37～54氨基酸。为进一步细化B8所识别的抗原表位,采用合成多肽,利用竞争ELISA,明确B8表位位于40～48氨基酸（RPQRNTDIN）。经过NCBI BLAST分析该氨基酸序列具有针对eLEF-1的特异性。4.异构体的表达研究首先利用B8抗体,联合抗野生型LEF-1兔单克隆抗体,通过激光共聚焦在乳腺癌细胞株MDA-MB-435、MDA-MB-231和MCF-7中对LEF-1异构体以及野生型LEF-1定位进行检测,结果显示两种荧光有重合,并提示可能存在LEF-1新的通读异构体。其次我们通过免疫印迹在6株乳腺癌细胞株中有5株发现该异构体的表达,其中MDA-MB-435细胞高表达该异构体;此外,在4例乳腺癌组织切片中,利用免疫组织化学检测该异构体,其中有1例阴性、2例弱阳性表达、1例强阳性表达,并初步发现该异构体可能与乳腺癌转移性相关。综上所述,本研究应用生物信息学分析了LEF-1可能存在一个新的因通读而产生的异构体;针对该异构体的通读段蛋白制备了一株特异性的单克隆抗体B8,并进一步明确了B8的抗原表位;利用该抗体在乳腺癌细胞株以及组织切片中发现了LEF-1异构体的表达,并有可能与乳腺癌转移性相关,为深入理解LEF-1结构与功能奠定了一定基础。
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