论文摘要
口腔扁平苔藓（oral lichen planus, OLP）是临床上常见的慢性炎症性口腔黏膜病,病因不明,无特异有效治疗方法,病程迁延,反复发作,具有一定恶变倾向,第14届国际癌症大会将其列为癌前病变,给病人造成很大痛苦和压力,是口腔内科临床一大难题。OLP的发病与精神、内分泌、免疫、感染等多种因素有关,其中免疫因素是OLP发病最为重要的机制之一。多数研究表明OLP属于一种细胞免疫异常性自身免疫性疾病,在OLP病损局部黏膜固有层有大量T淋巴细胞呈带状浸润,其中活化的T淋巴细胞触发口腔角质细胞凋亡是OLP发病发展的主要机制,然而活化的T淋巴细胞为何在局部异常浸润以及口腔角质细胞为何异常凋亡,其分子机制至今尚不清楚。癌胚抗原相关细胞粘附分子-1（carcinoembryonic antigen-related cellular adhesion molecule 1, CEACAM1）属于免疫球蛋白超家族和癌胚抗原家族分子,表达于人类某些特定上皮、内皮、淋巴样细胞和髓样细胞,是一种多功能的细胞表面糖蛋白,可以介导细胞间粘附和细胞内信号转导,能够调节细胞增殖、血管形成及胰岛素代谢。近年研究发现,CEACAM1还具有调节固有免疫和适应性免疫反应的重要功能。有研究报道,CEACAM1在几种自身免疫性疾病中异常表达,可能参与了这些疾病的发生发展。但其在OLP中的表达如何,国内外未见报道,而且CEACAM1在这些自身免疫性疾病中的表达调控以及在免疫病理中的作用亟待明确。骨桥蛋白（osteopontin, OPN）是细胞外基质中一种重要的分泌型糖基化磷蛋白,广泛参与细胞黏附、迁移、细胞免疫、创伤愈合、骨的改建,肿瘤转移等生理病理过程。有研究显示,OPN与CEACAM1在人妊娠胎盘绒毛外滋养层共表达,且在促进胎盘绒毛外滋养层细胞侵袭迁移上具有协同作用。在前期研究中,我们和魏本娟、周增同等发现,OPN在OLP患者病变黏膜上皮和外周血的表达明显高于正常,并对活化T淋巴细胞的凋亡具有显著抑制作用,但其分子机制尚不清楚。我们推测CEACAM1可能在OLP的免疫病理机制中发挥重要作用,并有可能与OPN存在着某种调控关系。我们首先检测了CEACAM1在OLP患者外周血T淋巴细胞及局部病变黏膜组织的表达,其次体外实验研究了OPN对T淋巴细胞和口腔角质细胞表面CEACAM1表达的调控,最后探讨了CEACAM1对活化T淋巴细胞和口腔角质细胞凋亡的作用。本研究的结果不仅为探索OLP的病理机制提供分子学基础,而且可为其它T细胞免疫异常性疾病的机制研究提供借鉴。第一部分CEACAM1在口腔扁平苔藓中的表达目的：研究CEACAM1在OLP患者及健康对照组外周血T淋巴细胞和局部病变黏膜组织中的表达,探讨CEACAM1在OLP发病机制中所起的作用。方法：1. CEACAM1在OLP患者及健康对照组外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面的表达检测：采集OLP患者及健康对照组外周静脉抗凝血,流式细胞学方法检测CEACAM1在外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面的表达。2. CEACAM1在OLP患者及健康对照组局部口腔黏膜组织中的表达检测：收集OLP患者及健康对照组局部口腔黏膜组织,免疫组织化学方法检测CEACAM1在局部口腔黏膜组织中的表达。结果：1.外周血T细胞表面CEACAM1的表达：OLP患者外周血CD8+T淋巴细胞中CEACAM1阳性的细胞平均为35.42%,约7倍于健康对照组（4.70%）（p<0.01）；OLP患者外周血CD4+T淋巴细胞中CEACAM1阳性的细胞平均为9.65%,亦明显高于健康对照组（5.15%）（p<0.05）。2.局部口腔黏膜组织中CEACAM1的表达：CEACAM1在OLP患者局部病变黏膜上皮组织的表达Fromowitz评分为4.98±1.61,明显高于健康对照组（2.35±1.18）（p<0.01）,而且OLP患者局部病变黏膜固有层浸润的炎细胞中有一部分表达CEACAM1,阳性率平均为12%,主要分布于炎细胞浸润带的深层及小血管周围。结论：CEACAM1在OLP患者外周血T淋巴细胞和局部病变黏膜组织中的表达明显异于健康对照组,提示CEACAM1可能在OLP免疫病理机制中起着重要作用。第二部分OPN对T淋巴细胞和口腔角质细胞表面CEACAM1表达的调节作用目的：我们前期研究发现OPN在OLP外周血和局部病变黏膜组织中表达显著增高,并对活化T淋巴细胞的凋亡有明显抑制作用,但其机制尚不清楚。本研究第一部分我们发现CEACAM1在OLP外周血T淋巴细胞表面及局部病变黏膜组织中的表达亦明显异于正常,本研究第二部分我们拟观察OPN对T淋巴细胞和口腔角质细胞表面CEACAM1表达的调节,探讨OLP中异常表达的CEACAM1是否由OPN调节,CEACAM1是否介导了OPN的免疫调节作用。方法：1.T淋巴细胞的分离：无菌采集健康志愿者外周静脉抗凝血,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）,免疫磁珠分选法分选外周血CD3+T淋巴细胞。2.OPN对原代T淋巴细胞表面CEACAM1表达的调节作用研究：新分离的健康志愿者外周血T淋巴细胞作为原代T细胞,分OPN刺激组和对照组,常规培养72小时,流式细胞学检测T淋巴细胞表面CEACAM1的表达。3.OPN对活化T淋巴细胞表面CEACAM1表达的调节作用研究：分离的健康志愿者外周血T淋巴细胞,体外以IL-2、anti-CD3 mAb和anti-CD28 mAb诱导活化,分OPN刺激组和对照组,常规培养72小时,离心留取上清,-80℃冰箱保存备用,流式细胞学检测T淋巴细胞表面CEACAM1的表达。4.OPN对正常口腔角质细胞表面CEACAM1表达的调节作用研究：常规培养的人正常口腔角质细胞（human oral keratinocytes, HOK）,在细胞生长至半数融合时,分别以重组的人OPN蛋白、活化T淋巴细胞培养上清、OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清、以及以IFN-γ中和抗体预处理的OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清进行刺激,继续培养48小时,流式细胞学检测HOK表面CEACAM1的表达。5.OPN对活化T淋巴细胞IFN-y分泌的影响研究：复溶实验3)留取的部分上清,酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测各组细胞培养上清IFN-y的浓度。结果：1.OPN对T淋巴细胞表面CEACAM1表达的调节作用：OPN能够显著诱导原代T淋巴细胞表面CEACAM1的表达（p<0.01）,而对活化T淋巴细胞表面CEACAM1的表达却具有明显抑制作用（p<0.05）。2.OPN对正常口腔角质细胞表面CEACAM1表达的调节作用：OPN本身对HOK细胞表面CEACAM1的表达无明显调节作用,但OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清可以明显上调HOK细胞表面CEACAM1的表达（p<0.01）,而此调节作用可被IFN-y中和抗体所抑制（p<0.05）。3.OPN对活化T淋巴细胞IFN-y分泌的调节作用：OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清中IFN-y的浓度显著高于对照组（p<0.01）。结论：OPN对不同活化状态的T淋巴细胞表面CEACAM1的表达具有不同的调节作用,而且OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清能够以IFN-y依赖的方式诱导口腔角质细胞表面CEACAM1的表达。提示在OLP中,OPN很有可能通过调节CEACAM1的表达而参与了疾病的发生发展。第三部分CEACAM1对口腔角质细胞和活化T淋巴细胞凋亡的调节作用目的：前两部分研究结果提示,在OLP中,异常上调的OPN很可能通过调节CEACAM1的表达参与了疾病的发生发展。本研究第三部分拟研究CEACAM1在OLP异常细胞凋亡中的作用,观察anti-CEACAM1 mAb对活化T淋巴细胞、口腔角质细胞以及与口腔角质细胞共培养的活化T淋巴细胞凋亡的影响,探讨CEACAM1在OLP免疫病理机制中所起的作用。方法：1.OPN对口腔角质细胞凋亡的影响研究：常规培养的HOK,在细胞生长至半数融合时,分别以重组的人OPN蛋白、活化T淋巴细胞培养上清、OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清以及以IFN-y中和抗体预处理的OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清进行刺激,继续培养48小时,流式细胞学检测HOK的细胞凋亡率。2. anti-CEACAM1 mAb对口腔角质细胞凋亡的影响研究：常规培养的HOK,在细胞生长至半数融合时,加入IFN-γ进行刺激,分anti-CEACAM1 mAb作用组和同型抗体对照组,继续培养48小时,流式细胞学检测细胞凋亡率。3. anti-CEACAM1 mAb对活化T细胞凋亡的影响研究：分离健康志愿者外周血T淋巴细胞,体外以IL-2、anti-CD3 mAb和anti-CD28 mAb诱导活化,分anti-CEACAM1 mAb作用组和同型抗体对照组,常规培养48小时,流式细胞学检测细胞凋亡率。4. anti-CEACAM1 mAb对与口腔角质细胞共培养的活化T细胞凋亡的影响研究：常规培养的HOK,在细胞生长至半数融合时,加入IFN-y进行刺激,48小时后分anti-CEACAM1 mAb作用组和同型抗体对照组,孵育30分钟,而后与anti-CD3 mAb、anti-CD28 mAb活化的T淋巴细胞共培养,无IFN-γ刺激的HOK作为阴性对照,48小时后流式细胞学检测T淋巴细胞凋亡率。结果：1.OPN对口腔角质细胞凋亡的影响：OPN刺激的活化T淋巴细胞培养上清可以明显促进HOK细胞的凋亡（p<0.01）,而此促进作用可被IFN-y中和抗体抑制（p<0.05）。HOK细胞凋亡率的变化趋势与其表面CEACAM1的表达趋势相一致。2. anti-CEACAM1 mAb对口腔角质细胞凋亡的影响：IFN-y可诱导角质细胞的凋亡（p<0.01）,加入anti-CEACAM1 mAb明显抑制了此诱导作用（p<0.01）。3. anti-CEACAM1 mAb对活化T细胞凋亡的影响：anti-CEACAM1 mAb明显抑制了活化T淋巴细胞的凋亡（p<0.01）。4. anti-CEACAM1 mAb对与口腔角质细胞共培养的活化T细胞凋亡的影响：IFN-γ刺激的口腔角质细胞可以促进共培养的活化T淋巴细胞的凋亡（p<0.01）,而以anti-CEACAM1 mAb对此角质细胞预处理明显抑制了此促进作用（p<0.05）。结论：CEACAM1对口腔角质细胞和活化T淋巴细胞的凋亡具有重要调节作用,在OLP中,异常上调的OPN很可能是通过调节CEACAM1的表达,影响活化T淋巴细胞和口腔角质细胞的正常凋亡,从而在OLP的发病发展中发挥着至关重要的作用。
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