论文摘要
背景和目的非酒精性脂肪肝（NAFLD）发病率呈逐年上升趋势,成为全球引起慢性肝病和肝功能异常的首要原因之一,在总体人群中患病率已高达15-30%。NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现,主要病理生理机制为胰岛素抵抗（IR）和氧化应激,病理表现为脂肪在肝脏积累。IR是以胰岛素抑制肝脏释放葡萄糖、促进周围组织摄取和利用葡萄糖的能力下降为特征的病理生理过程。在NAFLD状态下,肝脏的糖脂代谢紊乱导致肝脏葡萄糖和VLDL的输出增加,血浆甘油三酯浓度升高,高密度脂蛋白胆固醇（HDL）水平降低。而脂肪组织的糖脂代谢紊乱则引起脂肪组织葡萄糖摄取减少和脂肪分解增加,产生过量的游离脂肪酸以及甘油进入血液循环。蒙医“三根调节法”即依据蒙医对非酒精性脂肪肝（NAFLD）的病因病理机制的认识,以及“赫依”、“希拉”、“巴达干”等辩证论治理论,选出的对NAFLD疗效颇佳的利肝石榴八味散、地格达-4和通拉嘎-5三味方剂。利肝石榴八味散是祛“巴达干”的代表方剂;地格达-4是清“希拉”的代表方剂;通拉嘎-5是治疗“赫依”的代表方剂。利肝石榴八味散的主要成分为石榴、肉桂、豆蔻、荜茇、红花、草果、干姜、光明盐;地格达-4的主要成分为肋柱花、黄连、栀子、瞿麦;通拉嘎-5的主要成分为石榴、肉桂、豆蔻、荜茇、红花。蒙医辩证治疗糖尿病的临床疗效证明通拉嘎-5、利肝石榴八味散、地格达等药物成分有辅助降糖作用,还可以改善血液粘度,治疗早期糖尿病肾病,但其具体的作用机制不明。有文献报道以地格达-4为主药治疗NAFLD,可以使患者肝功能、B超等指标恢复正常。临床上有关于通拉嘎-5与辛伐他汀降脂效果的对比性研究,结果显示通拉嘎-5有明显的降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的作用,但至今没有关于利肝石榴八味散对脂代谢影响的相关研究报道。但蒙医“三根调节法”治疗NAFLD的具体机制尚不清楚,需要进一步的研究。本研究以3T3-L1脂肪细胞和NAFLD大鼠模型肝脏组织为研究对象,分别检测利肝石榴八味散、地格达-4、通拉嘎-5对它们的葡萄糖摄取和脂肪酸氧化的影响,并检测在糖脂代谢中发挥重要作用的PPARs、LXRα、IκBα、iNOS、Akt、P-Akt的表达变化,以期明确蒙医“三根调节法”治疗NAFLD的机制。方法:1、3T3-L1前脂肪细胞按照ATCC推荐的方法培养,加入IBMX（终浓度0.5mM）、地塞米松（终浓度1μM）、胰岛素（终浓度10mg/L）诱导分化为脂肪细胞。分化成熟的脂肪细胞用油红O染色的方法进行鉴定。2、将分化成熟的脂肪细胞接种于96孔板,用蒙药诱导细胞12小时、24小时、48小时、72小时,浓度分别为136.36mg/L、27.27mg/L、6.81mg/L、1.36mg/L、0.27mg/L,空白组和PBS组作为对照,吞噬MTT后检测OD值,每组至少重复3孔。3、选用终浓度6.81mg/L、27.27mg/L的蒙药处理细胞,PBS作为阴性对照共培养24h,[3H]2-DG示踪检测脂肪细胞的葡萄糖摄取, 14C-palmitic示踪检测脂肪细胞的脂肪酸氧化情况。4、选用终浓度6.81mg/L、27.27mg/L的蒙药处理细胞48h,空白组和PBS组作为对照,Real-time PCR检测其PPARs和LXRα基因表达情况,western blot检测其PPARs、LXRα、IκBα、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表达情况。5、Real-time PCR检测NAFLD大鼠模型肝脏组织PPARs和LXRα基因表达情况,western blot检测其PPARs、LXRα、IκBα、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表达情况。结果:1、3T3-L1前脂肪细胞培养、诱导分化、鉴定:3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞的过程中,胞浆脂肪滴由小变大,细胞形态逐渐变圆,在诱导分化的第9-10天左右分化成熟,油红O染色后胞浆脂肪滴着红色。2、MTT结果:三种方剂的最佳浓度均为6.81mg/L,最佳作用时间均为48h。3、葡萄糖摄取的结果:胰岛素有明显促进脂肪细胞葡萄糖摄取的作用;利肝石榴八味散和通拉嘎-5在胰岛素介导作用下均有促进脂肪细胞摄取葡萄糖的作用;地格达-4对3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的促进作用没有统计学意义。4、脂肪酸氧化的结果:利肝石榴八味散和通拉嘎-5高低浓度组均有促进脂肪细胞脂肪酸氧化的作用,但没有统计学意义;地格达-4的高低浓度组均有促进脂肪细胞脂肪酸氧化的作用。5、蒙药对脂肪细胞PPARs、LXRα基因和PPARs、LXRα、IκBα、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表达影响:（1）Real-time PCR结果:利肝石榴八味散作用于脂肪细胞后PPARα、β、γ的基因表达增加,而LXRα的基因表达显著下降;地格达-4作用于脂肪细胞后PPARβ基因表达显著增加,地格达-4高浓度组（27.27mg/L）的LXRα基因表达显著下降,但PPARα和γ基因表达无明显影响;通拉嘎-5作用于脂肪细胞后PPARα和β基因表达显著增加,通拉嘎-5高浓度组（27.27mg/L） LXRα的基因表达显著增加。而PPARγ基因表达有所下降,但没有统计学意义。（2）蛋白表达检测结果:利肝石榴八味散能够明显增加脂肪细胞PPARs、IκBα、Akt、P-Akt的蛋白表达,显著下调脂肪细胞LXRα和iNOS蛋白表达,并且高低浓度组存在差异;地格达-4能够明显增加脂肪细胞PPARα、PPARβ、IκBα、Akt、P-Akt蛋白表达,地格达-4高浓度组（27.27mg/L）显著下调脂肪细胞LXRα和iNOS蛋白表达,但对PPARγ蛋白表达无明显影响;通拉嘎-5能够明显增加脂肪细胞PPARα、PPARβ、IκBα、Akt、P-Akt蛋白表达,对PPARγ蛋白表达的增加作用没有统计学意义,通拉嘎-5高浓度组（27.27mg/L） LXRα蛋白表达显著增加,通拉嘎-5低浓度组（6.81mg/L）显著下调脂肪细胞iNOS蛋白表达。6、蒙医“三根调节法”对NAFLD大鼠模型肝脏组织PPARs和LXRα基因和PPARs、LXRα、IκBα、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表达的影响结果如下:（1）Real-time PCR结果:与空白对照组相比,NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、β、γ的基因表达显著下降,而LXRα基因表达显著增加;利肝石榴八味散和通拉嘎-5治疗后NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、β、γ基因表达明显增加,而LXRα的基因表达显著下降,且高低浓度组存在差异;地格达-4治疗后,NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、β、γ基因表达明显增加,但LXRα的基因表达无明显变化。（2）蛋白表达检测结果:与空白对照组相比,NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、PPARγ、Akt、P-Akt、IκBα的蛋白表达显著降低,而LXRα和iNOS蛋白表达显著增加,PPARβ的蛋白表达变化无统计学意义。利肝石榴八味散和地格达-4治疗后,NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、β、γ、Akt、P-Akt、IκBα蛋白表达明显增加,LXRα和iNOS的蛋白表达显著下降。通拉嘎-5治疗后,NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、γ、Akt、P-Akt、IκBα蛋白表达明显增加,LXRα和iNOS蛋白表达显著下降,PPARβ蛋白表达变化没有统计学意义。结论:1、3T3-L1前脂肪细胞被成功诱导分化为3T3-L1脂肪细胞,MTT实验显示三种方剂对脂肪细胞的最佳作用时间均为48h,最佳作用浓度均为6.81mg/L。2、利肝石榴八味散可促进脂肪细胞的葡萄糖摄取,其机制可能与增加PPARs、IκBα、Akt、P-Akt和抑制iNOS、LXRα表达有关。通拉嘎-5也有促进脂肪细胞葡萄糖摄取的作用,其可能是通过上调PPARα、PPARβ、LXRα、IκBα、Akt、P-Akt和下调iNOS表达实现的。不同的是,地格达-4主要是促进脂肪细胞的脂肪酸氧化,其作用机制为增加PPARα、PPARβ、IκBα、Akt、P-Akt而下调LXRα和iNOS蛋白表达。3、高脂饮食可以通过降低PPARα、PPARγ、IκBα、Akt、P-Akt表达,增加LXRα、iNOS表达,来增加大鼠肝脏的脂肪积累,产生IR和氧化应激等,进一步发展为NAFLD模型。利肝石榴八味散和地格达-4则使NAFLD大鼠肝脏组织PPARs、IκBα、Akt、P-Akt表达增加,LXRα和iNOS表达降低,以改善IR、氧化应激,治疗NAFLD。而通拉嘎-5使NAFLD大鼠肝脏组织PPARα、PPARγ、IκBα、Akt、P-Akt表达增加,LXRα和iNOS表达降低,以治疗NAFLD。