主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关A基因（MICA）抗体与临床肝移植排斥的相关性实验研究

论文摘要

目的:本研究旨在通过对主要组织相容性复合体I类分子相关A基因（MICA）的多态性检测,探讨MICA抗体在肝移植排斥反应过程中的作用机制。本研究包括:1)通过对主要组织相容性复合体I类分子相关A基因（MICA）转染的细胞系检测肝移植病人的血清,运用流式细胞仪检测是否产生针对MICA的抗体来探讨MICA抗体在肝移植免疫排斥反应中的影响机制。2)运用PCR方法检测22例发生肝移植排斥反应供、受体病人血清中的MICA的等位基因型,确定MICA*008等位基因在肝移植排斥反应中的作用机制。3)运用免疫组织化学方法进一步证实MICA抗原与肝移植排斥反应的关系。方法:课题第一部分:1)转染MICA的人类B淋巴母细胞细胞系（721.221）通过细胞培养后,同84例接受肝移植手术的病人的血清进行流式细胞仪检测,实验分为五组,第一组:MICA转染细胞（5×105个）+羊抗鼠抗体2微升（二抗,荧光抗体）;第二组:MICA转染细胞（5×105个）+抗MICA抗体（一抗,荧光抗体）+羊抗鼠抗体2微升（二抗,荧光抗体）;第三组:MICA转染细胞（5×105个）+AB血清（阴性对照）+羊抗人（IgG+IgM）10微升（二抗）;第四组:MICA转染细胞（5×105个）+阳性对照病人血清+羊抗人（IgG+IgM）10微升（二抗）;第五组:MICA转染细胞（5×105个）+抗MICA抗体（一抗,荧光抗体）+产生排斥反应的病人的血清+羊抗人（IgG+IgM）10微升（二抗）。各组再用抗MICA单克隆抗体封闭,以检测血清中的抗体是否是MICA特异性抗体。2)MICA转染细胞、胆管上皮细胞（BEC）、肝窦内皮细胞（LSEC）和肝细胞与5μl的抗MICA抗体结合,加入萤光抗体羊抗鼠IgG,分别行流式细胞仪检测,MICA的未转染细胞和MICA转染细胞分别作为阴性和阳性对照。课题第二部分:1)将22例发生肝移植排斥反应病人供体、受体的血清分别提取DNA并以分光光度计进行检测,采用PCR方法和标有MICA等位基因序列的引物进行电泳检测,分析记录电泳图,并与MICA等位基因图谱相对照得出各自的MICA等位基因型。2)从健康肝脏中分别提取胆管上皮细胞（BEC）、肝窦内皮细胞（LSEC）和肝细胞,细胞经过培养后,提取RNA及cDNA合成,以葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶（G6PD）被当作内生的正常对照,MICA的第一代细胞系和MICA转染细胞分别作为阴性和阳性对照组,分别行RT-PCR检测和免疫印记检测。课题第三部分:将已经病理检查确诊的13例肝移植并发生排斥反应病人的肝穿刺标本、15例没有发生排斥反应的肝移植病人的肝穿刺标本和11例患有结肠癌病人的结肠标本行免疫组织化学检查。其中没有发生排斥反应病人的标本设为阳性对照,患有结肠癌病人的结肠标本作为阴性对照。结果:1)总共22例（22/84）（26%）术前或/和术后病人产生MICA抗体,其中8例（8/84）（9.5%）为术前病人,14例（14/84）（17%）为术后病人,84例病人中,共有43例（43/84）发生排斥反应,在有MICA抗体组中,排斥发生率为63%（14/22）,在没有MICA抗体组中,排斥发生率为47%（29/62）,二者相比没有统计学差异。在非转染细胞组（721.221）没有发现MICA表达,而在转染组提示有高表达;用抗MICA单克隆抗体封闭后,血清与MICA转染的细胞系的结合被抑制,提示在这些病人血清中检测到的抗体是MICA特异性抗体。在MICA抗体阳性组和阴性组中,无论发生排斥反应及病人的存活与否,两组之间都没有临床联系。2)流式细胞仪分析显示,MICA的表达在MICA转染细胞的表面上;而做为阴性对照,胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞或肝细胞并没有发生任何变化,提示MICA的表达并不在这些细胞表面上。3)在肝移植供、受体中出现频率最高的MICA等位基因是MICA*008,在9例病人供体和受体的抗体当中检测到了MICA*008,其中,4例病人的供体和受体检测出MICA*008完全相配;发现在4例病人中,供体不匹配的MICA等位基因是MICA*008;5例病人中,供体不匹配的MICA等位基因不是MICA*002就是MICA*010。在14/22（63%）例发生排斥反应的病人中可以检测到MICA*008细胞系抗体,而在29/62（47%）例病人中没有检测到MICA*008细胞系抗体,二者之间没有显著性差异（P>0.05）。4)提取的新鲜肝脏细胞和抗MICA单克隆抗体经过免疫印迹法检测显示,62kDa条带与MICA多肽的相一致,这一结果仅见于MICA转染细胞而不是胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞。5)在那些发生排斥反应和没有发生排斥反应的肝移植病人标本中仅发现轻度的MICA抗原染色,而那些患有结肠癌并当作阴性对照组的病人,免疫组化显色后显示在上皮细胞有很强和散在的细胞质染色。结论:1)MICA的表达仅在MICA转染细胞的表面上,而在胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞或肝细胞并没有发生表达,提示MICA的表达并不在这些细胞表面上。2)MICA抗原仅在肝移植病人及发生排斥反应的肝移植病人的肝组织中发生微弱的表达,但却在结肠癌病人的结肠上皮组织中发生强烈表达。3)统计结果显示,在肝移植预留抗体中没有发现MICA等位基因的表达,与肾移植相比较,MICA抗原不是引起肝移植排斥反应的目标抗原

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 MICA 抗体在肝移植免疫排斥反应中的作用机制
• 1. 材料与方法
• 1.1 研究对象
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验设备
• 1.4 方法
• 1.5 间断性变性琼脂电泳（SDS-PAGE），免疫印迹和流式细胞仪检查
• 1.6 统计学方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第二部分 MICA008?008 等位基因对肝移植排斥反应的作用机制
• 1. 材料与方法
• 1.1 研究对象
• 1.2 溶液与试剂
• 1.3 主要实验器械和器皿
• 1.4 病人血清或全血中DNA 的提取
• 1.5 测定样本中的DNA 含量
• 1.6 MICA 等位基因型的确定
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第三部分 MICA 抗体在肝移植免疫排斥反应中的作用机制
• 1. 材料与方法
• 1.1 研究对象
• 1.2 实验溶液与试剂
• 1.3 实验设备
• 1.4 石蜡组织切片的HE 染色
• 1.5 石蜡组织切片的免疫组化染色
• 1.6 染色结果的判定
• 1.7 统计分析
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 个人简历
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 导师评阅表