论文摘要
第一部分:人脐带间充质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究目的探讨人脐带及脐静脉内皮下间充质干细胞（MSC）分离、培养方法,并对其生物学特性进行初步分析。方法无菌条件下收集足月妊娠剖宫产新生儿脐带,PBS洗去血管内的残存瘀血,用两种方法进行培养:1、组织块培养剔出脐带动静脉,组织剪将剩余组织剪碎至1mm3大小组织块。直接将组织块接种于DMEM-LG培养基进行原代培养。2、脐静脉内皮/内皮下分离培养将洗净的脐静脉灌入0.1%Ⅳ型胶原酶,37℃消化20分钟,收集消化液离心后接种培养。观察并记录其形态学变化,细胞达到融合状态时,消化传代进行纯化和扩增。流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志。绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期。结果两种分离方法均可获得成纤维样MSC。组织块贴壁法1周后于组织块间隙可见散在分布的纺锤型细胞,3周左右达80%融合。脐静脉胶原酶消化法,细胞接种后第二天即可见少量形态各异的贴壁细胞,散在分布。1周左右时,贴壁细胞形成集落,占优势的是成纤维样MSCs及少量铺路石样细胞,3周左右可达80%融合。经传代培养后,可得到较为纯化的成纤维样MSC,细胞约3天即可达到70%融合,需再次传代或冻存,细胞可传代20代以上。分别取第4代、第10代脐带MSC行流式细胞术表面标记检测,结果表明细胞表型无明显差异,高表达CD49e、CD29、CD44,低表达CD106、CD11b,不表达CD34,对第4、10代脐带MSCs生长曲线进行分析,其平均倍增时间为33.1h, 35.2h。流式细胞仪进行细胞周期检测表明,脐带MSCs有60-70%细胞处于G0-G1期。结论组织块贴壁法和脐静脉胶原酶消化法均可从脐带组织分离得到成纤维样MSCs。该细胞具有较强的增殖能力,细胞表面分子检测显示脐带来源的间充质干细胞表面标志与骨髓MSC相同。第二部分:人脐带间充质干细胞向神经细胞定向诱导分化的研究目的探讨bFGF联合N2添加剂对脐带来源MSCs向神经细胞分化的情况,进而为脐带MSC向神经移植提供理论依据。方法取第4代MSC消化后进行细胞爬片,细胞在玻片上生长3天后,即覆盖玻片的60%左右时,进行诱导分化。在诱导剂的培养液中加入30ng/ml bFGF﹢10ml/L N2添加剂。每天计数神经元样细胞分化率;每天取分化后的细胞爬片,用免疫组化的方法检测神经元样细胞特性性标志物Nestin、NSE、NF表达,并计数阳性细胞表达率,比较不同天数bFGF对神经细胞分化能力的差异。结果加入诱导液24小时后即可见部分MSCs胞体有一定的收缩,胞体成球形或不规则,胞体折光性变强,3天后大部分MSCs出现明显形态改变,有的细胞突起进一步伸出二级或三级分支,并可见轴突、树突及胞体的椎样改变,在细胞密集处突起交织成网,4天后,绝大部分细胞形态都已发生了向神经细胞的改变,分化率达87.7%,此后部分细胞脱落、死亡,多数细胞可存活10天以上。诱导分化后的第2天行免疫组化即可见Nestin表达成强阳性,约35.03%,于第4天达到高峰70.88%,NSE和NF第7天染色阳性率分别达到50.1%、47.51%。结论人脐带间充质干细胞具有向神经细胞分化的潜能,神经营养剂N2联合bFGF能提高脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的分化率。
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