喹乙醇及其代谢残留的免疫检测技术研究

论文摘要

喹乙醇是一类被限量使用的兽药添加剂,其在动物体中主要代谢为3-甲基喹啉-2-羧酸。这两种化合物对人类的健康造成极大的威胁。本文旨在研究建立检测喹乙醇及其代谢物的免疫学检测方法。本文合成了针对喹乙醇及其代谢物的半抗原,尤其在代谢物检测方面,首先利用一种新颖简单的方法合成了代谢物3-甲基喹啉-2-羧酸,然后合成了四种新的半抗原,然后分别与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）,卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）交联,制备成免疫抗原,包被抗原。用免疫原免疫新西兰白兔制备抗血清,得到特异性高的抗体,效价达到了32000,通过筛选,得到了针对代谢物的多克隆抗体。通过ELISA优化,喹乙醇的IC50值达到了151.89ng/mL,检测限为4.33ng/mL;3-甲基喹啉-2-羧酸的IC50值达到了3.84ng/mL,检测限为0.25ng/mL。文章利用代谢物的抗体,建立了基于抗体抗原反应和纳米DNA技术的荧光猝灭高灵敏检测方法,检测更加灵敏,首先合成了纳米磁性粒子和纳米金粒子,通过将DNA与纳米金粒子偶联,得到了纳米探针,并代替传统的HRP与二抗进行偶联,之后在流动注射系统中进行完免疫反应后,对纳米探针上的DNA进行变性,收集得到了单链DNA序列,再将这些单链DNA与另一种粒径更小的且具有互补寡核苷酸序列的金纳米探针进行杂交,信号被放大后,利用荧光猝灭进行检测,检测限被大大改善,达到了7.52pg/mL,检测范围为8.5到60pg/mL。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 喹乙醇及其代谢物简介
• 1.2 色谱法等一些相关仪器检测方法
• 1.2.1 分光光度法
• 1.2.2 联用技术
• 1.2.3 吸附溶出伏安法
• 1.3 免疫分析方法
• 1.3.1 免疫半抗原的设计
• 1.3.2 结合抗原
• 1.3.3 载体的选择
• 1.3.4 半抗原与载体连接的数目及鉴定
• 1.3.5 抗体的产生
• 1.4 基于免疫学的纳米检测技术
• 1.4.1 DNA 纳米技术简介
• 1.4.2 纳米金应用于生物分析化学的原理
• 1.4.3 纳米金探针在生物分析化学中的应用
• 1.5 展望
• 1.6 课题研究内容与意义
• 第二章 喹乙醇人工抗原的的合成
• 2.1 试剂和仪器
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 喹乙醇半抗原的合成
• 2.2.2 喹乙醇人工抗原的合成
• 2.2.3 试验结果与分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 3-甲基喹啉-2-羧酸的合成与鉴定
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 3-甲基-2-乙酰喹啉的鉴定
• 3.2.2 3-甲基-喹啉-2-羧酸的鉴定
• 3.3 本章小结
• 第四章 3-甲基喹啉-2-羧酸人工抗原的合成与鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 半抗原的制备
• 4.2.2 免疫原的制备
• 4.2.3 包被原的合成
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 3-甲基喹啉-2-羧酸人工半抗原的鉴定
• 4.3.2 3-甲基喹啉-2-羧酸人工抗原的鉴定
• 4.3.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第五章 免疫动物及抗血清的制备
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 主要溶液
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 抗血清的制备
• 5.2.2 抗血清的分离
• 5.2.3 间接ELISA 方法的初步建立
• 5.2.4 血清效价的测定
• 5.2.5 利用间接ELISA 方法初步建立标准抑制曲线
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 喹乙醇的效价测定
• 5.3.2 利用间接ELISA 方法测定喹乙醇的抑制曲线
• 5.3.3 MQCA 的效价测定
• 5.3.4 利用间接ELISA 方法比较不同MQCA 抗体对检测灵敏度的影响
• 5.3.5 交叉反应
• 5.4 本章小结
• 第六章 基于纳米粒子的荧光猝灭定量检测方法的建立
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 主要试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 金纳米探针的制备
• 6.2.2 超顺磁纳米粒子的合成和修饰
• 6.2.3 流动注射系统中的免疫反应
• 6.2.4 金纳米探针的荧光猝灭定量检测
• 6.2.5 样品制备
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 纳米粒子的表征
• 6.3.2 顺序流动注射系统的选择和优化
• 6.3.3 荧光猝灭定量MQCA
• 6.3.4 相关方法的比较
• 6.3.5 真实样品分析
• 6.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录