论文摘要
研究背景:原发性胆汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis,PBC）是以胆管上皮细胞损伤为特点的器官特异性自身免疫性肝病,伴门脉炎症性改变和AMA阳性,最终导致胆汁淤积、肝脏纤维化甚至肝硬化。目前PBC的发病机制尚不清楚,可能与固有免疫和适应性免疫的异常相关。CXCR3是一种趋化因子受体,主要表达在T细胞上,通过与CXCL10、CXCL9和CXCL11三种配体结合发挥它的作用。在多种疾病中,CXCR3和它的配体在募集白细胞去炎症部位以及T细胞的活化过程中发挥了重要的作用。鉴于T细胞在PBC的发病中发挥的重要作用,推测CXCR3和其配体在PBC发病中可能发生一定的作用,目前国内外尚无相关报道。TLR3是TLR家族中的一个重要成员,与宿主抗病毒免疫和一些自身免疫性疾病的发生存在密切关系。双链RNA——poly I:C是TLR3的配体,TLR3通过关键性传接分子—TRIF激活多种信号分子,活化转录因子NF-κB和IRF-3,诱导Ⅰ型干扰素和大量炎症因子的产生。由于poly I:C注射雌性C57BL/6野生鼠可以建立PBC动物模型,推测TLR3介导的信号通路在PBC发病中可能发挥一定的作用,目前国内外尚无相关报道。研究目的:建立野生鼠和CXCR3-/-（CXCR3基因敲除）小鼠的PBC动物模型;研究CXCR3在PBC发病中的作用;初步探索TLR3介导的信号通路在PBC发病中的作用;从适应性免疫和固有免疫两方面,研究PBC的发病机制。研究方法:6至8周雌性C57BL/6野生鼠和C57BL/6 CXCR3-/-鼠,腹腔注射5mg/kg的polyI:C,每周2次,第8周、第16周、第24周和第28周收集小鼠肝脏、血清标本、肝脾单个核细胞;收集血清检测肝功能,IIF和ELISA检测AMA,ELISA检测CXCL10滴度;病理检测及免疫组化分析肝脏炎性细胞浸润程度;流式细胞仪分析小鼠肝脏、脾脏的淋巴细胞亚群;用免疫印迹法比较正常对照组和PBC模型组之间小鼠肝脏中TLR3、TRIF和p-NFκB p65的含量差异。结果:一、CXCR3在PBC模型发病中的作用（一）PBC野生鼠模型组与对照组之间的比较:1.与对照组相比,PBC模型组的AMA滴度和ALP水平明显增高,P＜0.05;2.Poly I:C腹腔注射后,第8周可见小胆管周围炎性细胞浸润,胆管上皮细胞变性坏死,基底膜不完整;第16周可见小叶间胆管增生,淋巴细胞浸润;第24周可见小胆管损伤、闭塞,胆管内胆栓形成,周围淋巴细胞浸润,肉芽肿形成,炎症从门脉区发展到肝实质;第28周可见早期纤维化形成,肝细胞坏死、再生,可疑假小叶形成;3.流式分析结果显示,野生鼠PBC模型组肝脏CD3+、CD4+和CD8+细胞上表达CXCR3的比例明显高于脾单个核细胞,P＜0.05;PBC模型组肝脏CD3+、CD4+和CD8+细胞上表达CXCR3高于对照组,其中CD8+细胞有统计学差异,P＜0.05;对照组脾脏CD3+和CD8+细胞上表达CXCR3明显高于PBC模型组,P＜0.05;4.与对照组相比,PBC模型组肝脏单个核中CD3+细胞的比例明显高于对照组,P＜0.05;PBC野生鼠模型组肝脏CD3+细胞中CD4+和CD8+细胞的比例明显高于对照组,P＜0.05;5.免疫组化结果显示,野生鼠PBC模型组第8周肝脏可见汇管区CXCR3+细胞浸润;第16周和第24周肝脏可见肝脏汇管区CXCR3+细胞浸润数目逐渐增加;在各个发病时期,CXCR3+细胞浸润与CD4+和CD8+细胞浸润的部位较一致;6.野生鼠PBC模型组第8周肝脏可见汇管区CD4+和CD8+细胞浸润;第16周、24周可见肝脏汇管区CD4+和CD8+细胞浸润数目逐渐增加;第24周肝脏可见CD8+淋巴细胞主要集中在肝内小胆管周围;除汇管区外,肝实质也可见少量CD4+和CD8+淋巴细胞浸润;7.ELISA检测PBC模型组血清中CXCL10抗体的平均滴度较对照组明显升高,P＜0.05,随着病程的进展,CXCL10抗体滴度呈逐渐上升的趋势。（三）野生鼠PBC模型组与CXCR3-/-鼠PBC模型组的比较:1.CXCR3-/-小鼠和野生鼠PBC模型组之间的AMA滴度和ALP水平无显著差异;2.PBC野生鼠模型组和PBC CXCR3-/-鼠模型组肝脏单个核细胞中T细胞的比例无明显差异;3.CXCR3-/-鼠PBC模型组病变程度较同期的野生鼠PBC模型组轻,第8周可见部分小胆管周围少量炎性细胞浸润,第16周汇管区炎性细胞浸润较前增多,至第24周时无胆栓和纤维间隔形成;4.CXCR3-/-小鼠模型组血清CXCL10抗体的平均滴度较对照组明显增高;与野生鼠PBC模型相比,CXCR3-/-小鼠模型CXCL10抗体的平均滴度更高,第24周时两者有显著性差异。二、TLR3介导的信号通路在PBC模型发病中的作用1.免疫印迹结果显示,PBC模型组小鼠肝脏中TLR3的含量均较正常对照组升高,不同时期野生鼠PBC模型组之间TLR3的相对含量无明显差异,与第8周相比,第16周和24周CXCR3-/-小鼠TLR3的相对含量有下降趋势;2.各个时期PBC模型组肝脏中的TRIF的相对含量较正常小鼠无明显变化,野生鼠和CXCR3-/-小鼠PBC模型组之间TRIF的相对含量无明显差异;3.各个时期野生鼠PBC模型组肝脏中的p-NFκB p65的相对含量与正常小鼠无明显差异,CXCR3-/-小鼠PBC模型组肝脏中的p-NFκB p65的相对含量较正常小鼠升高。结论:1.通过poly I:C腹腔注射可使遗传易感性雌性C57BL/6小鼠出现PBC样改变;2.在PBC模型的发病过程中,CXCR3和它的配体在趋化T细胞尤其是CD8+T细胞去肝脏的过程中发挥一定的作用;3.CXCR3和它的配体对于PBC模型中肝脏的T细胞比例无明显影响,它对于活化T细胞可能发生一定的作用;4.敲除CXCR3有助于减轻和延缓小鼠PBC模型的病情进展;5.TLR3在PBC动物模型中的含量增高,TLR3介导的信号通路在PBC模型发病中可能发生一定的作用;6.在PBC动物模型的发病中,TLR3介导的信号通路中未能大量活化NF-κB,它可能主要通过IRF-3——最终产生1型干扰素诱导疾病的发生;7.CXCR3对PBC模型发病中TLR3介导信号通路的作用无显著影响。
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